糖化酶活力测定

《生物产品的分析与检验技术》酶制剂的分析与检验——次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力酶：生物催化剂酶制剂：酶的工业化制剂酶活力的测定是酶产品检测的主要项目之一，也是衡量一个酶产品品质的主要指标。常见的酶活力测定法有滴定法、分光光度法和紫外分光光度法等。本节课以饲料用原料糖化酶中酶活力的测定为例介绍滴定法测定糖化酶活力的方法。次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力

（一）原理

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（二）试剂与仪器

1.试剂碘、碘化钾、冰醋酸、醋酸钠、蒸馏水、NaOH、商品葡萄糖淀粉酶、可溶性淀粉、浓硫酸、硫代硫酸钠、Na2C03

2.仪器恒温水浴锅、秒表、比色大试管、滴定管、碘量瓶、容量瓶、锥形瓶、移液管等次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程可溶性淀粉制备待测酶液的制备加试液反应滴定酶活力的计算

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程1.可溶性淀粉溶液制备：称取绝干淀粉2g，用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，加热煮沸至透明，冷却后定容至100ml，此溶液需当天配制。次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程可溶性淀粉制备待测酶液的制备加试液反应滴定酶活力的计算

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程

2.待测酶液的制备：称取定量酶粉精确至0.0001g，先用少量的缓冲液溶解，用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程可溶性淀粉制备待测酶液的制备加试液反应滴定酶活力的计算

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程3.加试液反应：于甲乙两支比色管(50ml)中，分别加2％可溶性淀粉溶液25ml，0.1mol/LpH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，摇匀。将试管置于40℃的恒温水浴中预热5～10min。在甲管中加酶制备液2ml(酶活总量110～170U)，立即计时，摇匀，在此温度下准确反应1h，1h后立即各加20％NaOH溶液0.2ml，摇匀，将二管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶液2ml(作为对照)。次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程可溶性淀粉制备待测酶液的制备加试液反应滴定酶活力的计算

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程4.滴定：分别取上述反应液5ml放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加0.1mol/LNaOH溶液15ml(边摇晃)，暗处放置15min，加入2mol/L硫酸2ml.用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程可溶性淀粉制备待测酶液的制备加试液反应滴定酶活力的计算

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程5.结果记录与酶活力的计算：结果记录将所测数据填入下表

消耗标准硫代硫酸钠溶液的体积（ml）V样品消耗V0空白消耗

次亚碘酸滴定法检测糖化酶的活力（三）操作流程

5.结果记录与酶活力的计算：酶活力的计算X=（V0-V）c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×（V0-V）c×n式中：X—样品的酶活力[u/g（u/ml）];V0—空白消耗Na2S2O3标准溶液的体积（ml）V—样品消耗Na2S2O3标准溶液的体积（ml）;C—Na2S2O3标准溶液的浓度（mol/L）90.05—与1.00mlNa２S2O3标准溶液[c（1/2Na2S2O3）=1.000mol/L]相当的以克表示的葡萄糖的质量32.2—标准溶液的体积（ml）;5—吸取反应液的体积（ml）;1/2—吸取酶液2.00ml，以1.00ml计;n—样品稀释倍数;2—反应30min，换算成1h的酶活力系数（四）注意事项

1.可溶性淀粉称量前要烘至绝干，淀粉溶液需当天用当天配，配制时要注意不要让淀粉液喷出来，煮沸时要沸腾2min；2.酶液配制时要注意用玻璃棒捣研，使沉淀中的酶充分溶解到溶液中，定容后摇匀时要注意慢摇，防止起泡引起酶液表面张力的变化，致使体积损失；3.量取各溶液体积时要分别润洗移液管3次，管子外壁要擦干净，使定量刻度更准确。4.滴定操作时一定要边滴定变摇晃碘量瓶，滴加速度随着越接近