蛋白质分离和纯化

蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析及传统的透析法均为膜分离技术。

原理：

大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过膜，使分子大小不同的物质得到分离。

技术关键：

根据欲分离成分的具体情况选用规格适宜的过滤膜。

不同膜过滤被截留的分子大小有区别。如运用超滤，选用适当规格的膜可实现对中药提取液中多糖类、多肽类、蛋白质类的截留分离。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。等电点pI=5pH=6环境-pH=4+环境--++000凝聚*盐析疏水性物质间的亲和力：水笼

Clathrate●

水分子会包围在非极性分子四周，形成类似竹笼的结构，隔离非极性分子，水分子本身的流动性因此而降低。*

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。■

各种盐析及沉淀法的比较

Saltingin盐溶Saltingout盐析有机溶剂沉淀蛋白质分子表面的帶电基团蛋白质分子表面的非极性基团除了hydrophobic

之外的其他作用力NaCl(单价离子)硫酸铵(两价离子)甲醇、丙酮等蛋白质在其pI下，因净电荷为零而聚集沉淀；若加入盐类，阻碍其聚集而增加溶解度。两价离子在溶液中抢走附在蛋白质表面(非极性部分)的水分子，使非极性部分相互吸引聚集沉淀。降低水活性，溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，而聚集在一起。影响因素试剂机制其它说明对较低浓度缓冲液透析是saltingin的反向过程。1)非极性蛋白质较早沉淀。2)在硫酸铵中蛋白质相当稳定。1)部分蛋白质变性。2)有助沉淀的因素：蛋白质分子量大、缓冲液pH靠近pI。3)脂溶性蛋白质的溶解度反而增加（三）电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。样品浓缩胶分离胶+使用较厚的间隔条1/21/4三、根据电荷不同（一）电泳（PAGE、毛细管电泳和IEF）、聚焦层析-蛋白质浓度高时可用紫外线直接观察(1)电泳后取出胶体(3)胶片两侧各切出一条胶体(2)目标蛋白质可能位置？(4)进行染色或活性测定(5)比对原胶体兩侧位置后切出目标蛋白质++9753-0Ampholyte+聚焦在pI在低pH处带正电被排斥-+在高

pH处带负电被排斥--*等电聚焦电泳（IEF）■双向电泳10050257564IsoelectricPointkDSDSPAGEpH（四）层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。离子交换层析载体++++++++++++++++样品分子流动相固定相阳离子基团Counterion阴离子+（五）超速离心超速离心法(ultracentrifugation)在重力作用下，Pr在溶液中逐渐沉降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降结束。既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。

*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。三、多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用