高级实验技术实时荧光定量PCR

关于高级实验技术实时荧光定量PCR23.05.20231第1页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20232常规PCR的定量在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。第2页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20233PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。第3页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20234Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA第4页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20235影响PCR扩增效率的因素:PCR定量的困难?引物/靶的杂交反应试剂的相对量样本在扩增仪中的位置的不同临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR扩增模板的量靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低第5页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20236定量的最佳时期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#第6页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20237PCR和定量问题

高浓度/高效率

高浓度/低效率

低浓度/高效率

N : 扩增分子的数目n : 扩增循环的次数log-phaseanalysisNnend-pointanalysis第7页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20238为克服上述不足，人们设计出包括内标法、外标法、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。第8页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.20239内标法在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。第9页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202310定量PCR

——外标准方法

在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA）如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量第10页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202311定量PCR

——外标准方法第11页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202312定量PCR

——外标准方法优点：方法简便，容易建立使用双孔重复测定可得到非常准确的结果甚至可排除管间的差异不能排除样本间的差异第12页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202313定量PCR

——外标准方法缺点PCR反应体系的微小区别也会对测定造成较大的影响在扩增效率上的差异，会使定量测定精密度和重复性不佳第13页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202314使用外标定量的要求必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性必须在扩增的指数期进行第14页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202315竞争法将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。第15页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202316酶联免疫利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体－辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标－标准曲线实现定量检测的目的。第16页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202317酶联杂交法捕获探针（检测TNF-α）

3'–TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2-5'检测探针（检测TNF-α）

3'-Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATCGGGTA-5'第17页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202318

：NH2标记的探针

：Biotin标记的探针Avidin-HRP显色系统

：NOS基团酶联杂交法第18页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202319定量PCR

——动力学方法

首先，确定PCR扩增的效率（E）然后，根据相应的公式计算原始模板数第19页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202320影响PCR扩增效率（E）的因素整个扩增过程中：E取决于：引物/靶核酸的杂交反应试剂的相对量DNA聚合酶/靶核酸之比例*其他可能影响E的因素（系统之间的差异）样本在扩增仪中的位置不同的临床样本中DNA聚合酶抑制物的去除程度靶核酸链的再退火及酶过量可致Ev降低第20页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202321改良方法：极限稀释分析首先将原始模板进行梯度稀释然后对该稀释系列进行PCR扩增测定最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模板第21页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202322

极限稀释法示意图第22页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202323

极限稀释法优点：不需要特殊设备方法简单缺点：第23页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202324

极限稀释分析的缺点①必须建立扩增反应条件的标准化：如初始含量、试剂浓度和比例、循环参数等②不同批次的PCR测定的效率有可能不同，因而测定重复性较差③含低拷贝数的样本中存在高斯（Gaussian）（正态）分布。因此，为正确判定最低阳性样本，必须对每一稀释度多次重复测定

严格注意污染，避免假阳性的产生第24页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202325传统PCR定量方法的特点和不足1.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。第25页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023262.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。传统PCR定量方法的特点和不足第26页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202327实时荧光定量PCR在PCR反应体系中引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对每一循环扩增反应产物DNA片段的累积情况进行实时监测记录，通过数学模型实现对起始模板的定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。第27页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202328实时荧光定量与常规PCR的区别常规PCR：

通过电泳、酶联等后处理技术，对PCR扩增反应的终末产物进行定量及定性分析。实时荧光定量PCR：通过引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对PCR扩增反应过程中每一轮循环产物的累积进行实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。第28页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202329PCRRealtimePCRS1S2M实时荧光定量与常规PCR的区别第29页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202330在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一基团（受体）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于100Å）时，以供体基团的激发波长进行激发，可获得由受体基团发射的荧光。第30页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202331即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量直接转移给了受体。在此过程中没有光子的参与，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供体－受体两个基团之间距离的6次幂倒数成正比例。第31页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202332FRET产生条件1.存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠常用的FRET组合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

第32页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202333

2供体和受体的距离足够近：1-10nm

（1－10nm为分子内/间互作的距离：如蛋白质构象转变、酶催化反应等。）

——超显微观察

3合适偶极方向

4足够荧光寿命 无FRETFRETFRET产生条件第33页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202334荧光域值线（fluorescencethresholdline）：背景荧光与荧光信号的分界值，可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的10倍。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念第34页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202335阈值第35页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202336ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR扩增过程中，各反应管的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循环次数（指数扩增的开始阶段）。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念第36页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202337CT值荧光信号穿过阈值线时的循环次数第37页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202338

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，由此可对样本中目标基因的含量进行精确计算。初始模板浓度的确定第38页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202339DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies第39页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202340用Ct值定量的意义实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。

第40页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202341

相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图

终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

第41页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202342绝对定量成为可能灵敏度高：可检测10–100个细胞中１个拷贝数量的基因低拷贝基因的检测细小倍数差异样品的检测实时荧光定量PCR的优势第42页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202343线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓度样品可以在一次实验中同时检测定量高表达和低表达基因荧光探针使PCR产物检测特异性进一步提高全封闭无PCR后处理*几乎没有污染机会实时荧光定量PCR的优势第43页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202344

相对定量和绝对定量：相对定量指的是确定样本中靶序列相对于另一参照样本中靶序列量的变化值，绝对定量指的是确定样本中靶序列的拷贝数。实时荧光定量PCR的定量方法第44页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202345相对定量的方法：标准曲线法比较Ct值法绝对定量的方法：标准曲线法实时荧光定量PCR的定量方法第45页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202346标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是未知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列与标准序列的比值。相对定量方法第46页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202347比较Ct法:运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物量，在PCR反应的指数期得到Ct值来计算起始模板的量。前提：靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致。相对定量方法第47页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202348标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列的绝对含量。质粒DNA和体外转入的RNA常用作绝对定量标准品。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来换算成其拷贝数。绝对定量方法第48页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202349DNA结合染色：SYBRGreen1水解探针：TaqManMolecularBeacons荧光标记引物杂交探针实时荧光定量PCR使用的荧光化学方法第49页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202350SYBRGreenISYBRGreen1第50页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202351SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第51页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202352BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理第52页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202353SYBRGreenI工作原理第53页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202354荧光强度Vs温度荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI重新游离到溶液中Tm是熔解曲线的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲线分析第54页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202355以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲线分析第55页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202356SYBRGreen熔解曲线分析

第56页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202357SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜第57页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202358SYBRGreenI反应体系的设计反应体系的组成：传统PCR反应体系+SYBRGreenI1.SG浓度：终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000第58页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202359

2.Primer浓度：设计原则同普通PCR

终浓度50nM－300nM

固定模板浓度的梯度实验不加模板的对照实验（NTC）

——有无非特异信号SYBRGreenI反应体系的设计第59页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202360

熔解曲线的分析——是否单峰

建议使用HPLC纯化的引物3.MgCl2浓度

降低MgCl2浓度以减少非特异性产物

最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对照SYBRGreenI反应体系的设计第60页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202361

4.反应温度和时间参数：反应温度参考所用酶的种类；退火温度使用温度梯度功能优化；反应时间与常规PCR类似；扩增片断一般为200－300bp。SYBRGreenI反应体系的设计第61页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202362不同读板温度对实验结果的影响：80℃第62页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202363不同读板温度对实验结果的影响：86℃第63页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202364

SYBRGreenI的特点和不足不涉及特异的探针，方法设计简单，特异性差；荧光强度依赖于体系中所有的dsDNA分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。

第64页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202365优化的读板温度

-高于非特异产物的Tm值

-低于目标产物的Tm值AmpliconNon-specificproducts熔解曲线分析的应用第65页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202366TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针第66页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202367TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补第67页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202368RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理第68页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202369Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；长度不应超过30碱基，18-30bp,optimal20；5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。第69页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202370Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的Cs>Gs；扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现；引物应尽量靠近探针；引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基；避免引物、探针之间的二级结构。第70页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202371引物、探针浓度的优化目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值引物浓度：50nM－900nM

探针浓度：50nM－250nM

通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计第71页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202372Taqman探针的不足采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高；采用酶外切活性，受酶性能影响；探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA第72页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202373Molecular

BeaconsMolecularBeacons发夹型杂交探针第73页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202374MolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环第74页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202375Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

第75页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202376MolecularBeacons特点和不足对目标序列有很高的特异性；是用于SNP检测的最灵敏的试剂之一；采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低；不能完全与模板结合，稳定性差；探针合成标记较复杂。第76页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202377引物/探针设计和评估相关的免费网站

1．引物/探针的设计

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Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

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GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

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第77页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202378

1．引物/探针的设计

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FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

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PerlPrimer(OwenMarshall)

/

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PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探针设计和评估相关的免费网站第78页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202379．2.反转录(RT)PCR引物设计

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ExonPrimer(TechnischeUniversität,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

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AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特异性的验证

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Blast(NCBI) /BLAST/引物/探针设计和评估相关的免费网站第79页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202380

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GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

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OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

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OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

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mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/引物/探针设计和评估相关的免费网站第80页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023815．扩增子二级结构的评估

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mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探针设计和评估相关的免费网站第81页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202382实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测；肿瘤研究；基因表达研究；免疫组份分析；基因突变及多态性的研究第82页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202383实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测：检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据；检测HIV的量预测发病时间；选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。第83页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202384实时荧光定量PCR技术的应用

肿瘤研究：癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断；检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。第84页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202385基因差异表达研究标准曲线法

使用标准曲线来确定基因表达上的差异相对定量法(2－△△Ct法)

不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系第85页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202386标准曲线法步骤：1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比较不同样品间目标基因表达差异第86页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202387相对定量法前提目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100％。步骤通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值均一化校准△Ct=Ct目标基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同时间、不同组织)基因差异表达的倍数＝2－△△Ct第87页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202388基因突变及多态性-SNP检测第88页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202389基因分型方法

使用TaqMan探针

(双色法)溶解曲线

(单色法)序列特异PCR(单色法)第89页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202390FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探针进行基因型分析SNP检测-基因型分析第90页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202391QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色双通道技术应用-基因型分析第91页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202392从病人血液样品中提取DNA基因型分类：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色双通道技术应用-基因型分析第92页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202393Allele1controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析第93页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202394Allele2controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析第94页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202395HeterozygotecontrolFAMVIC多色双通道技术应用-基因型分析第95页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202396VICFAM第96页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202397多色双通道技术应用-基因型分析第97页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202398SYBRGreenI进行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配会导致PCR效率上有大约1000倍的差异，由此导致产物积累会有10个cycles延迟

末端匹配与否，与反应终产物量的多少没有必然联系

PCR#1PCR#2第98页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.202399SYBRGreenI进行SNP分析MatchMismatch第99页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023100SYBRGreenI进行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile第100页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023101SYBRGreenI进行基因分型Intensity-dI/dT第101页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023102TaqMan®MicroRNA分析方法

加长靶基因的反转录荧光定量PCR第102页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023103miRNAs的研究

MicroRNAs是一种内源性长度在２２个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与mRNAs结合抑制翻译或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各种生命体中发现的miRNAs类型共有约700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测其中人源的约有２００种高丰度存在：平均每个细胞中约有50,000个拷贝第103页，课件共116页，创作于2023年2月23.05.2023104为什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一类新的基因调控因子某些miRNAs控制了动植物的发育理解miRNA的功能将帮助现在流行的siRNA实验结果：RNA干扰／基因沉默MicroRNA