基因工程-克隆子筛选（动物生物技术）

动物生物技术转化子的筛选概念

克隆子：将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。转化子：把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子），现在这两者有通用的趋向。重组子：含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。克隆子的筛选转化子重组子目的重组子三者的关系转化子的筛选与重组子的鉴定转化子重组子期望重组子克隆子的筛选

为什么要进行克隆子的筛选？在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。1、在连接产物中既有载体和一个或数个串联目的基因的连接2、也有载体自连3、还有目的DNA分子自连4、更多的是违法生连接反应的载体和目的DNA片段

重组可能出现四种情况转化子的筛选与重组子的鉴定

转化子的筛选与重组子的鉴定方法基于载体选择标记基因筛选转化子

利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子

基于报告基因筛选转化子

报告基因多少是酶基因，或组装在载体中，或作为外源DNA的一部分。由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此识别被转化的细胞或未必转化的细胞。

基于形成噬菌斑筛选转化子

对于λDNA载体系统而言，可以采用是否能够形成噬菌斑来进行筛选。转化子的筛选

基于载体选择标记基因筛选抗药性筛选法（插入失活、插入表达）营养缺陷性筛选法显色模板筛选法除草剂抗性筛选法@1234转化子的筛选

基于载体遗传标记的筛选与鉴定

在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为筛选转化子的依据。转化子的筛选

1、抗药性筛选筛选大肠杆菌转化子的部分抗生素抗性基因和相应的选择药物转化子的筛选

1、抗药性筛选抗药性筛选法抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRⅠ位点：

非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHⅠ位点：

非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs转化子的筛选

1、抗药性筛选抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板，再将Ap平板上的转化子影印到含有Ap和Tc的平板上在Ap平板生长、但在

Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。转化子的筛选

插入失活筛选法

如pBR322质粒载体，有Tcr和Apr两个抗药性筛选基因，当外源DNA片段插入BamHⅠ酶切位点上时，使Tcr基因表现插入失活，破坏了Tcr基因表达，故阳性重组子表现Tcs表型，而质粒本身表现Tcr表型。所以当转化细菌液涂布在Ap固体培养基上，转化子及非转化子都能长成菌落，当转化细菌液涂布在Tc平板上时，含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌不能长而成菌落。

利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活，Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型，而质粒本身为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。转化子的筛选插入表达筛选法

常见的营养缺陷型筛选标记：用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk--缺陷型。转化子的筛选营养缺陷型筛选DNA合成途径有两种

常用于高等哺乳动物典型的筛选方式：HAT选择法HAT选择法：由于选择培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），这是一种选择性培养基，主要针对含有选择标记的目的基因转化子的筛选。基本原理：利用培养基中的叶酸类似物氨基蝶呤(APT)阻断细胞核苷酸的正常合成途径，启动以次黄嘌呤为底物的补救合成途径（不受氨基蝶呤的抑制，能继续合成出所需核苷酸）。HAT培养基中有外源的胸苷，通过胸苷激酶的作用，tk+能以其为底物合成出TTP，则tk+细胞可继续存活；而tk-细胞无这种合成作用，则死亡。转化子的筛选筛选方式

显色筛选法的基本原理：转化子的筛选显色互补筛选法

显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。转化子的筛选

显色筛选法显色筛选法的基本操作：

将外源基因克隆pUC18的lacZ’标记基因内部，使之失活，此时重组子呈Apr、lacZ—，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落。

转化子的筛选α互补的检测

α互补的检测

转化子的筛选转化子的筛选除草剂抗性筛选法由于植物细胞对多数抗生素不敏感，所以常用抗除草剂基因作为选择标记基因。pat基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。sul基因来源于抗药性质粒R46，编码二氢喋呤合成酶，使转化子对磺胺类除草剂有抗性。csV1-1基因编码乙酰乳酸合成酶，使转化子对磺酰脲类除草剂有抗性。epsps基因表达产物是5-烯酮丙酮酸莽草酸-3磷酸合成酶EPSP突变体，使转化子能抗甘草磷。转化子的筛选基于报告基因筛选

报告基因：是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入宿主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。转化子的筛选基于报告基因筛选克隆子抗生素抗性基因作为报告基因①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）：抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418（氨基糖苷类抗生素）等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）：赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）：也被用于筛选动植物转化子的标记基因。转化子的筛选基于报告基因筛选克隆子β-葡萄糖酸酶基因（gus）作为报告基因gus的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。

由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。

尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。转化子的筛选基于报告基因筛选克隆子萤火虫荧光素酶基因（luc）作为报告基因

luc表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。

Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产物的背景干扰，因此，Luc是一种理想的报告基因。转化子的筛选基于报告基因筛选克隆子绿色荧光蛋白基因（gfp）作为报告基因