基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序当前第1页\共有69页\编于星期三\2点复习1.什么是基因工程？2.基因工程的基本工具有哪些？3.基因工程的最大优点？4.“分子手术刀”、“分子缝合针”和“分子运输车”分别指什么？5.质粒的本质、特点是什么？载体的种类、必须具备的条件？当前第2页\共有69页\编于星期三\2点1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作分四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物体内的转化才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达当前第3页\共有69页\编于星期三\2点一、目的基因的获取（一）目的基因的概念：编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子（二）获取目的基因的常用方法有哪些?1.从基因文库中获取2.利用PCR技术扩增3.人工合成当前第4页\共有69页\编于星期三\2点1.从基因文库中直接获取（1）基因文库的概念：（2）基因文库的分类:种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库（3）获取目的基因的依据：当前第5页\共有69页\编于星期三\2点某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体（4）基因文库的构建方法限制酶与运载体连接基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接部分基因文库（cDNA文库）导入导入当前第6页\共有69页\编于星期三\2点①基因组文库的构建通过对受体菌的培养而储存基因当前第7页\共有69页\编于星期三\2点②cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)当前第8页\共有69页\编于星期三\2点①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物_____复制_____________的核酸合成技术。

③条件：_______________________________、_____________________、_______________、________________________________②原理：________________④方式：以_________方式扩增，即____⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列（前提）四种脱氧核苷酸一对引物耐热的DNA聚合酶（Taq酶）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增2.利用PCR技术扩增目的基因当前第9页\共有69页\编于星期三\2点⑥过程：a.DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下，_______断裂，形成__________。b.退火(复性55℃-60℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。

c.延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的_________。氢键单链DNA双链DNA链当前第10页\共有69页\编于星期三\2点PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制主要在细胞核热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子当前第11页\共有69页\编于星期三\2点目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：3.人工合成目的基因当前第12页\共有69页\编于星期三\2点

1.下列属于获取目的基因的方法的是①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术合成⑤利用DNA转录形成⑥人工合成①

②

③⑤

B.①

②

⑤

⑥

C.①②③④

D.①②④⑥D当前第13页\共有69页\编于星期三\2点二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。启动子插入基因表达载体复制原点抗生素基因终止子基因表达载体模式图当前第14页\共有69页\编于星期三\2点2.基因表达载体的组成(1)启动子(2)终止子(3)目的基因(4)标记基因等它们各自的作用是什么?启动子插入基因表达载体复制原点抗生素基因终止子当前第15页\共有69页\编于星期三\2点知识点一原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区：非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。包括启动子和终止子①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。当前第16页\共有69页\编于星期三\2点非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子启动子:位于基因首端的一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质。(以模板转录然后脱落)终止子:位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。当前第17页\共有69页\编于星期三\2点真核细胞的基因结构编码区非编码区：外显子:能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等。编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子

外显子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子:不能编码蛋白质的序列知识点二真核细胞的基因结构当前第18页\共有69页\编于星期三\2点原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码当前第19页\共有69页\编于星期三\2点②在细胞质中将mRNA分离并加入反转录酶③合成第二条DNA链外显子内含子外显子外显子内含子真核细胞的基因①在细胞核内转录RNA②在核内内含子被切去，外显子彼此连接③在细胞质中将mRNA分离并加入反转录酶④合成第二条DNA链基因的cDNA不含内含子mRNA原核细胞的基因①在细胞质内转录当前第20页\共有69页\编于星期三\2点启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。启动子插入基因表达载体复制原点抗生素基因终止子当前第21页\共有69页\编于星期三\2点质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端二个切口获得目的基因DNA重组DNA分子（重组质粒）同一种3.过程:连接酶当前第22页\共有69页\编于星期三\2点①切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的粘性末端，利于重组质粒的构建。②插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。注意：当前第23页\共有69页\编于星期三\2点资料科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。启动子插入基因表达载体复制原点抗生素基因终止子然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。

资料证明：载体构建组成要完整当前第24页\共有69页\编于星期三\2点①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意当前第25页\共有69页\编于星期三\2点三、将目的基因导入受体细胞(一)转化：(二)转化方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入________内，并且在受体细胞内维持________和_______的过程受体细胞稳定表达当前第26页\共有69页\编于星期三\2点1.将目的基因导入植物细胞的方法：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力①农杆菌特点：（1）农杆菌转化法当前第27页\共有69页\编于星期三\2点种子植物裸子植物被子植物双子叶植物单子叶植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麦、玉米…双子叶植物－网状脉单子叶植物－平行脉当前第28页\共有69页\编于星期三\2点②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。当前第29页\共有69页\编于星期三\2点植物肿瘤当前第30页\共有69页\编于星期三\2点当前第31页\共有69页\编于星期三\2点③过程：④优点：比较经济和有效Ti质粒T-DNA携带外源基因的DNA构建表达载体转入农杆菌含目的基因的重组Ti质粒导入植物细胞植物细胞将目的基因插入染色体的DNA中表现出新性状的植株农杆菌转化法示意图当前第32页\共有69页\编于星期三\2点Hind限制性酶ⅢHindIIIHindIII目的DNATi质粒苏云金杆菌构建表达载体Bt毒素蛋白基因

苏云金杆菌T-DNA(可转移-DNA)农杆菌转化法的过程：目的DNAamp黏性末端在质粒的tet基因内切开目的DNA质粒和外源DNA的HindⅢ限制性酶切示意图DNA连接酶当前第33页\共有69页\编于星期三\2点脱分化导入植物细胞通过组织培养产生新个体再分化移植个体生物学水平的鉴定如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达导入植物细胞组织培养农杆菌当前第34页\共有69页\编于星期三\2点（2）基因枪法：适合单子叶植物（3）花粉管通道法：如抗虫棉目的基因子房花粉管通道法当前第35页\共有69页\编于星期三\2点2.将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物当前第36页\共有69页\编于星期三\2点3.将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合细胞吸收DNA分子感受态Ca2+处理法当前第37页\共有69页\编于星期三\2点

若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗？

不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器。以酵母菌作为工程菌可以吗?可以，酵母菌为真核生物（真菌类）当前第38页\共有69页\编于星期三\2点四.目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—(分子水平)鉴定———（个体水平）①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译出蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原-抗体杂交当前第39页\共有69页\编于星期三\2点（一）检测1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)①首先取出转基因生物的基因组DNA②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:当前第40页\共有69页\编于星期三\2点目的基因片段非目的基因片段目的基因片段放射性标记基因探针基因探针目的基因的检测示意图当前第41页\共有69页\编于星期三\2点DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。当前第42页\共有69页\编于星期三\2点2.检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交②过程:

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA当前第43页\共有69页\编于星期三\2点提取3.检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质(抗原)

出现杂交带脱分化组织培养证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样当前第44页\共有69页\编于星期三\2点例:用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。（二）鉴定——个体生物学水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验当前第45页\共有69页\编于星期三\2点

不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。当前第46页\共有69页\编于星期三\2点归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：分子水平；是否插入、转录、翻译鉴定：个体生物学水平当前第47页\共有69页\编于星期三\2点1.有关基因工程的叙述正确的是A.限制酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作为运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习当前第48页\共有69页\编于星期三\2点2.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成目的基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C练习当前第49页\共有69页\编于星期三\2点3.(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的

处，DNA连接酶作用于

处。（填“a”或“b”）aa当前第50页\共有69页\编于星期三\2点(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和________________________________________。(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用______________技术，该技术的核心是__________和_______________。基因枪法植物组织培养（花粉管通道法）脱分化再分化当前第51页\共有69页\编于星期三\2点(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_____________作探针进行分子杂交检测，又要用______________________方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。耐盐基因浓度盐水浇灌一定当前第52页\共有69页\编于星期三\2点

4.（2009年天津高考改编）为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。如图是获取植酸酶基因的流程。酵母菌DNAmRNAcDNAcDNA文库基因组文库含目的基因的菌株目的基因Ⅰ含目的基因的菌株目的基因Ⅱ提取提取构建筛选筛选构建ABC分离分离当前第53页\共有69页\编于星期三\2点

据图回答：（1）图中基因组文库cDNA文库。（2）B过程需要的酶是（3）目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中和为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是（4）A、C过程中都是筛选获取目的基因的过程，请说出筛选的依据大于逆转录酶DNAcDNA耐高温可依据基因的相关信息（基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物及基因的表达产物等）获取目的基因。当前第54页\共有69页\编于星期三\2点5.下列有关基因工程的叙述,正确的是(

)。A.载体上的标记基因有利于促进目的基因在受体细胞中表达B.用逆转录法合成胰岛素基因时只能从胰岛B细胞中提取相关的模板C.目的基因导入受体细胞后,引起受体细胞的变异属于基因突变D.限制性核酸内切酶和DNA聚合酶是基因工程中两类常用的工具酶B当前第55页\共有69页\编于星期三\2点6.利用生物工程的方法可以让大肠杆菌生产人胰岛素。下面有关叙述错误的是(

)。A.在进行基因操作时,将人工合成的人胰岛素基因连接到质粒上,再转移到大肠杆菌中B.人胰岛素基因能够在大肠杆菌体内得以表达,是因为这两类生物具有完全相同的代谢方式C.能合成人胰岛素的大肠杆菌从可遗传变异的类型上看属于基因重组D.大肠杆菌制造的胰岛素,需要进一步的加工和提纯才能使用B当前第56页\共有69页\编于星期三\2点7.下列有关基因工程中运载体的说法中，正确的一项是（

）A.在进行基因工程操作中，被用作运载体的质粒都是天然质粒

B.所有的质粒都可以作为基因工程中的运载体

C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子

D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因D当前第57页\共有69页\编于星期三\2点8.科学家已经将鱼的抗冻蛋白基因成功的导入到番茄体内，培育出具有很强耐寒能力的番茄。请回答下列有关问题：

⑴要获得该抗冻蛋白基因，可采用

等方法。从鱼的体内切割该抗冻蛋白基因所用的是

，其特点是⑵某种细菌中的一种叫做EcoRI的限制