建库筛库流程(修改稿)

nirK基因文库的构建实验要求：实验操作中一定要戴手套，并使用70%的酒精消毒；并且每间隔一定时间（5-10min）再对手套进行消毒。实验台面用70%的酒精擦干净。实验过程中根据中间结果检查实验的可靠性。提前做好实验准备，灭好枪头、离心管等实验耗材。在实验中所用冰冻试剂在冰上完全融化后再用。实验过程中注意定量，如跑胶是上样量为3卩1,Marker为3卩1。对公用试剂用完后请及时保存到-20度或4度冰箱，防止试剂变质。该实验流程不准随便改动，若有需改动的请教党老师。（一）宏基因组DNA的提取采用土壤DNA快速提取试剂盒（FastDNASpinkitforsoil）及FastPrep-24核酸提取仪进行提取。DNA提取的质量决定后续实验的准确性和可靠性。每个站位均用0.3g（勿超0.3g，冰冻状态）的沉积物样品进行DNA提取。具体操作过程如下：（1）向LysingMatrixZtube中加入0.3g沉积物样品（勿超0.3g），1100^1裂解液溶解。裂解液组成为978山磷酸钠缓冲液和122plMT缓冲液。（均质化土样，使提的DNA含RNA量最少）。注意：离心机提前预冷15min，至4T。（2）将上述离心管放入FastPrepInstrment中，设定速度5，离心时间40s。（3） 4°C离心机，将上述离心管以14000Xg离心lOmin。（4） 将上清移入新的1.5ml离心管中加入250plPPS，并轻柔颠倒10次将其混匀。（5） 将上述混合液以14000Xg4°C离心5min，将上清移入另两个新的1.5ml离心管中（每管加500yl），将BindingMatrixSuspension摇匀，悬浮，向上述上清中加入500^l的BindingMatrixSuspension。（6） 用手轻柔颠倒混匀2min，将管放置于管架上静置3min（4C冰箱）。（7） 每管吸出300山上清（即每个站点吸出300*2），将之丢弃（注意勿扰沉淀），使余下的上清与BindingMatrix混匀，将600卩l的混合液（任一管）移入纯化柱（spinfillter）中14000Xg离心1min，倒掉收集管中的废液，将剩余的（另一管）BindingMatrix全部移入纯化柱中14000Xg离心1min，倒掉收集管中的废液。（8） 向纯化柱中加入500卩1已加入乙醇的SEWS-M,14000xg离心lmin,倒掉收集管中的废液，重复三次后，以14000xg离心2min,以使SEWS-M洗脱液被全部除去。（9） 将纯化柱移入新的收集管中，室温下空气中干燥纯化柱5min。（10） 加入50卩1DES,并且用枪头清搅滤膜或用手指轻弹使DNA溶解，静置1min（55°C水浴5min），以14000Xg离心1min，使DNA转移到收集管中。再加40卩1重复以上步骤，最后共得到80plDNA样品。提取的DNA先分装样品（10卩1/管），-80C冰箱保存。取一管用1卩1在1%的琼脂糖凝胶做电泳检测，Marker用九DNA/HindIII，95V，45min。（二） nirK基因序列的PCR扩增（梯度与平行同一天完成）1、 准备工作：4C离心机、制冰机提前打开，灭菌黄色切头枪头-20C冰箱中预冷，灭菌ddH2O,大小离心管，大小枪头超净工作台紫外灭菌15min。头一天预约PCR仪。冰盒（PCR体系准备好），无水乙醇（-20C）。所有的酶、Buffer、引物等都进行分装，防止污染。2、 取出DNA，冰上解冻，用冷却的无菌切头黄色枪头轻轻吹打DNA，4C，lOOOOrpm离心5min。取1.5卩1DNA稀释20X（1卩1+19卩1水），取出10ul的原液。剩余DNA放回-80C冰箱。3、 梯度PCR实验，PCR体系12.5卩1，模板梯度分别为稀释（1DNA+19ddH2O）的0.5，1，2，4，原液0.5，1.0卩1PCR体系（使用新的PCR体系）:ddH2OBuffer1.25卩1dNTP(2.5mM)1.00p!Mgcl2(25mM)0.75p!BSA(1yg/y1)1.00p!引物nirKF1(20yM)0.25p!引物nirKR1(20yM)0.25p!模板DNA0.5，1，2，4，原液0.5，1.0y1Taq酶（2.5U）（随用随拿）0.10p!同时做阳性对照和阴性对照。阴性对照：模板用无菌ddH2O；阳性对照：模板用带有该基因的质粒。

厂94r预变性厂94r预变性5minPCR反应程序丿、、94r变性1min、50r退火1min >35cycles72r延伸2min丿72r延伸10min4、 取3卩1PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。选取特异性高的，非特异性扩增少，条带清晰的并且产量适宜（与DNAmarker对比）的浓度。5、 平行PCR根据梯度PCR结果选取最佳浓度模板进行平行PCR实验。用12.5卩1体系，做20个平行，加阴性对照。ddH2OBuffer1.25卩1dNTP(2.5mM)1卩1MgCl2(25mM)0.75卩1BSA(200ng/|il)1.0卩1引物nirKFl(20yM)0.25^1引物nirKR1(20pM)0.25^1模板DNA梯度PCR后最好的浓度Taq酶（2.5U）（随用随拿）0.1^11.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。（三）PCR产物的乙醇沉淀（平行PCR琼脂糖凝胶电泳检测后立即做，沉淀时间至少过夜）1） 将检测后的平行PCR产物全部加在一起，估计体积。（在超净台内做）2） 调整单价阳离子浓度。若DNA溶液中含有高浓度的盐，可用TE（pH8.0）稀释，否则加入盐。3） 充分混匀溶液，准确加入2倍体积的冰冷乙醇（-20D（注意乙醇用量一定要足够，否则DNA很难沉淀下来，这要求PCR产物的体积估计要准确），再充分混匀（颠倒混匀）溶液。将此含乙醇的溶液置-20°C过夜使DNA沉淀形成。4） 在离心管底用记号笔标出沉淀即将出现的位置，把离心管放入离心机时，注意标记处朝上。于0C，13000rpm，离心20min回收DNA。（第二天早上）5） 小心移出上清液至另一灭菌离心管，注意不要搅动沉淀（有时沉淀是看不见的），用吸头吸尽附于管壁的所有液滴并移入另一灭菌离心管中。6） 加500^170%乙醇（先4°C保存），0C13000rpm离心4min。7） 重复步骤58） 离心管室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥发干。9） 将DNA沉淀重新溶解于适当体积（20吐左右）的缓冲液（一般为7.6〜8.0TE）或无菌去离子水中，充分漂洗管壁。（四）PCR产物纯化4.切胶纯化4.1制胶：使用Genefinder专用三角瓶，胶浓度1.5%，体积30ml，3ulGenefinder染色，避光条件下凝固（因为Genefinder见光极易分解）。样品预染：计算样品需要的预染液量:每20ulDNA溶液需6ul预染液。Genefinder：6XLoadingBuffer=1：9比例配置预染液，将样品与预染液混匀，冰上预染3min。D2000Marker与Genefinder的预染：5plD2000Marker加入1plGenefinder，与样品一起冰上预染3min。点样：电泳槽要事先清洗干净，用新缓冲液配胶，新缓冲液90V电压，电泳45-50min。时间视目标基因片段大小及PCR质量而定（避光）。蓝盾切胶玻璃板和新手术刀片用70%酒精喷过，吸水纸擦净，将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽可能切得干净）。切完一个样品之后，用喷过70%酒精的吸水纸将刀片和玻璃板仔细擦过，防止样品之间的交叉污染。4.5PCR产物纯化：利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行切胶纯化，具体操作步骤见说明书。注：最后DNA溶解体积20”。琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.AGelExtractionKit说明书准备工作浓缩的SPWBuffer需用乙醇按如下稀释：D2500-00&D2501-00&D2502-00加入20ml100%的乙醇;D2500-01/02&D2501-01/02&D2502-01/02每瓶加入100ml100%的乙醇;注意:稀释后的DNAWashBuffer需室温保存;所有步骤必须在室温下进行.操作方案配制琼脂糖EB凝胶，电泳以分离DNA片段•任何类型或等级的琼脂糖都可以使用.我们强烈的推荐使用新鲜的TAE电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液，旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量；2．1．称取空离心管的重量，2.电泳足够时间后，在蓝盾切胶机下小心地把所需的DNA片段切下来•并尽量去除多余的凝胶.注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒，蓝盾配合Genefinder可在白光下显色切胶.切下带目的片段的凝胶（注意切胶要位置准确，不要把过长或过短的DNA片段切下来），装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积.一般情况下，凝胶的密度为lg/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的BindingBuffer,把混合物置于60°C水浴中温浴7min至凝胶完全融化（注意观察一定要完全融化），其间每隔2-3分钟混匀一次；重要提醒:在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-BindingBuffer混合物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少•观察混合物的颜色，如果是橙色或红色，则要加入5“l浓度为5M,pH5.2的醋酸钠，以调低其pH值•经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.一般情况下，使用新鲜的电泳缓冲液，凝胶-Bindingbuffer混合物的PH值的不会升高；转移700》l的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTMDNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10,000Xg离心lmin,弃去液体.（一个HiBindDNA柱子最多可容纳700》l的溶液，如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700》1,可先转移700》l溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上.但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25〜30》gDNA•如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱中•）将柱子重新套回收集管中,加300》lBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室温下,10000Xg离心1分钟,去弃滤出液;这一步相当关键，不要忽略此步.将柱子重新套回收集管中，加入700》1SPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室温下,10,000Xg离心1分钟,去弃滤出液;注:SPWWashbuffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释.将柱子重新套回收集管中，重复加入700》1SPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10,000Xg离心1分钟，弃去滤出液;，将空柱子重新套回收集管中,10,000Xg离心1min以甩干柱基质残余的液体.这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步 对得到好的DNA产量是十分重要的.把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入20》1洗脱液（elutionbuffer）柱子膜上,10,000Xg离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度.（五）纯化PCR产物的连接（连接可以随时做，连接反应时间越长越好，至少要过夜）将目的基因连接到质粒载体pMD19-TSimpleVector（Takara,大连宝生物）上。连接体系（总体积5gl）（注意先阅读试剂盒说明书）：PCR产物2plpMD19-TSimpleVector0.5ylSolution2.5yl于16°C连接2h后，4°C连接至少过夜。该试剂为公用试，剂用完后请及时放回-20度冰箱，否则会影响试剂在以后使用中的连接效率。（六）感受态细胞的制备（提前做好）1） 从新鲜的大肠杆菌DH5a培养平板上接种一环菌落于5mlLB液体培养基，37C培养过夜。2） 按0.5%〜1%的比例转接于100mlLB液体培养基，37C培养2〜4h，当菌液0D600约为0.3。3） 将菌液转移到预冷的50ml离心管中，冰浴30min，4000rpm离心10min。4）去上清，沉淀悬浮于5ml预冷的0.1M的CaCl2溶液中，冰浴15min,4000rpm离心10min。5）去上清，沉淀悬浮于2ml预冷的0.1M的CaCl2溶液中，冰浴10min,4000rpm离心10min。6） 去上清，沉淀悬浮于1ml预冷的0.1M的CaCl2溶液中，加入高压灭菌的甘油至终浓度15%。7） 取200“分装于1.5ml的tip管中，于-8O°C保存，备用。8） 制备后的感受态细胞需立即进行验证转化效率，（没有验证过的或验证转化效率达不到要求的感受态细胞不要用！）做好下一天转化准备准备转化用的液体SOC（4°C）、固体LB/Amp/X-Gal/LPTG培养基和LB/Amp培养基（需要1OOmg/ml的AMP（氨苄青霉素），1000x实际工作浓度；IPTG和X-Gal母液分别为240mg/ml和50mg/ml）。见附录《培养基的配方》（七）转化（第三天下午，培养14~16小时）1） 打开循环水浴，并使温度恒定在42°C（注意用温度计检测实际温度）。2） 从-8O°C冰箱取感受态细胞，放在冰上缓慢融化；用冷却的无菌吸头将重组载体加入200pl用CaCl2溶液制备的感受态细胞悬液中（重组DNA体积不超过10pl，DNA小于10ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。3） 将离心管放入恒温至42°C的循环水浴中，放置90s，不要摇动管。热激是一个关键步骤，准确达到热激温度非常重要。4） 快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。5） 每管加入800plSOC培养基（提前备好，放于4°C待用），用水浴将培养基加温至37°C,然后将离心管转移到37°C摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因。（用低于50r/min的转速的摇床）。5） 将适当体积已转化的感受态细胞转移到LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基上，进行梯度涂布，作50pl、100pl、100pl、200pl、200pl、300pl六个板。6） 将平板置于室温直至液体被吸收。7） 倒置平板，于37°C培养，12-16h后可出现菌落。8） 取出培养板于4°C放置数小时使之显色。

9）从克隆数约200个的同一个平板上用平头牙签随机挑选约200个白色菌斑，将挑选出的阳性克隆在含1OOpg/m1氨苄青霉素的LB-AMP固体平板上用平头牙签划菌落，一个板20-30个左右划格标号，防止交叉污染，于37°C培养过夜。（第五天挑克隆，随时注意生长状况，不要长过）10）第五天挑菌进行菌落PCR，并用封口膜封好平板倒置保存于4°C,并保持15天转接一次。或挑至试管，进行保种。（八）克隆的PCR扩增（每个库挑150个，两天做完）用水煮法快速提取细胞中的质粒DNA,将菌加入200卩1灭菌的去离子水中,沸水煮5min,冰上放置5min,然后4C,12000rpm,离心5min,取20卩1上清到新的离心管中做PCR的模板。PCR反应体系：25p1（同时做阴性对照）ddH2O14.6p1Buffer2.5p1dNTP2.0p1MgC122.0p1M13-D1.5p1RV-M1.5p1模板DNA0.8p1Taq酶0.1p194C预变性3min厂94厂94C变性反应程序Y 58C退火72C延伸72C延伸45s 、lmin卜30cycles1.5min（视基因片段长度而定）10minPCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，Marker用D2000。（九）限制性酶切分析（做完PCR后，马上酶切，晚上酶切过夜，三种酶耗时间较长第二天跑电泳）（一个库大约需要一周）选用能盖严的灭菌PCR管，做好标记。片段大小正确的nirK基因PCR产物分别用MspI、HhaI和TaqI限制性酶进行酶切，酶切反应于37°C过夜。PCR反应可能强弱不一（应尽量争取一致），做酶切时注意用量调节，PCR产物过弱的要重新做PCR，不要直接做酶切。三个酶切体系如下表，MspI，HhaI为6卩1体系37°C培养箱酶切14-16小时，TaqI酶65C烘箱酶切14-16小时（写好酶切纸条）。由于温度高可能导致挥发，PCR管放入烘箱和培养箱之前一定要盖严。酶切反应一定要完全。MspI和HhaI酶切体系6pl酶切缓冲液0.6yl限制性内切酶（MspI/HhaI）0.3ylPCR产物DNA2.7卩1（个别根据PCR产物强弱调节）无菌超纯水2.4卩1TaqI酶切体系9卩1酶切缓冲液0.6卩1限制性内切酶（TaqI）0.45^lPCR产物DNA2.7卩1（个别根据PCR产物强弱调节）无菌超纯水5.25卩1酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳分析，电压65V，40min，60min，80min,120min分别拍一次照（nirKA基因）。将得到的所有的酶切电泳图进行比对，酶切产物条带长度之和大于预期（产物长度+载体）的片段认为是假阳性，需划线纯化后再作酶切。根据凝胶图像的酶切带型划分分类操作单元（OTUs）（对于相似酶切带型，如果难以辨别是否相同，则暂时划为不同的OTU,待进一步测序后再合理准确判断）。对于同一文库中的所有不同OTUs，找到相应的克隆菌株保种（每种OUT至少保3个不同序号的克隆，对于只有1~2个克隆的OUT，对所有克隆进行保种）（十）序列测定将基因文库中所有的分类操作单元（OTUs）进行测序。将需要测序的阳性克隆接种于LB-AMP（含120pg/mlAMP）液体培养基，37°C摇床培养过夜（12〜14h）,将菌液送至上海生工测序。OTUs保种：冻存管用油性记号笔做好标记（检查记号笔是否好用，是否防水）；每管灭菌冻存管加入560卩1菌液、240卩150%灭菌甘油，漩涡振荡混匀5min,静置2min后再振荡混匀5min,-80C保存。文库中一个0TU只有1或2个克隆的，保存所有克隆，一个0TU有三个或三个以上克隆的，保存三个克隆。若测序结果不好，将不好的菌株进行划线，挑单克隆，转板，再煮菌PCR,酶切，与之前0TUs进行比对，送测序，整理。测序得到好的结果后及时保种，并整理菌种盒把没用的菌株扔掉，换成新的。附录：SOC培养基配方（100ml）：2.0g胰蛋白胨，0.5g酵母膏，1ml1MNaCl,0.25ml1MKC1,1m12M的葡萄糖（过滤除菌）。Ampicillin（氨卡青霉素）（100mg/ml）组份浓度100mg/mlAmpicillin配制量50ml配制方法1.称量5gAmpicillin置于50ml离心管中。加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。用0.22pm过滤膜过滤除菌。4•小份分装（1ml/份）后，-20C保存。IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）（24mg/ml）组份浓度240mg/mLIPTG配制量50mL配制方法1.称12gIPTG置于50ml离心管中。加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。用0.22pm过滤膜过滤除菌。4小份分装（1ml，份）后，-20C保存。X-Gal（50mg/ml）组份浓度50mg/mlX-Gal配制量50ml配制方法1.称量50mgX-Gal置于1.5ml离心管中。2.加入1mlDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解

LB培养基组份浓度 l%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨),0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物),1%(W/V)NaCl配制量lL配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加NaOH调节pH值至7.0。加去离子水将培养基定容至1L。5高温高压灭菌LB/Amp平板培养基组份浓度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl0.1mg/mlAmpicillin1.5%(W/V)Agar配制量1L配制方法1.称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加NaOH调节pH值至7.0。4