扩增片段长度多态性课件

MolecularMarkers分子标记的各种类型

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

CompanyLogoCompanyLogoMolecularMarkers限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）1随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）2简单重复序列ＤＮＡ（ＳＳＲ）3扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）4

其他种类的分子标记5CompanyLogo限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。RFLP技术主要包括以下基本步骤：

DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。

RFLP遍布整个基因组，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisma）限制性内切酶片段长度多态性)作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中，但它运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处，它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、还是由缺失、插入造成的。

限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）基本原理：

特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶（restrictionenzymes,RE）酶切消化后，会产生数万条DNA片段，通过琼脂糖电泳将这些片段按大小顺序分离开，转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交，若某一位置上的DNA片段与探针的序列相似，则探针就结合到这个位置上，通过放射性自显影或酶学检测，可以显示出不同材料含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异，即多态性。限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）特点:具有共显性的特点；RFLP标记具有种族特异性，对于分析一个分离群体的不同来源的染色体片段具有重要价值；RFLP标记遍及整个基因组；不足：主要表现在所需DNA量大，步骤复杂，需要的仪器、设备较多，周期长，成本高，检测中利用放射性的同位素，易造成环境污染；CompanyLogo随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）RAPD技术是建立在PCR(PolymeraseChainReaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下,进行PCR扩增[1]。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系RAPD标记原理:

RAPD标记的原理与PCR技术原理相同。在模板DNA、引物和4种碱基存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，以合成特异DNA片段的一种方法。PCR反应分变性（denaturation）、复性（annealling）、延伸（extension）三步。PCR原理:双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。CompanyLogo随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）DNA的制备RAPD扩增数据处理RAPD技术的步骤

检测未知序列的基因组DNARAPD标记为显性标记，极少数为共显性标记引物无种族特异性RAPD技术简单RAPD标记的最大缺点是再现性差特点

SSLP(simplesequencelengthpolymorphism)即简单序列长度多态性，是由于简单序列的重复次数不同，导致扩增片段长度的不同而产生的多态性。简单重复序列ＤＮＡ（ＳＳＲ）SSR标记的特点数量几乎无限，检测出多态性的频率极高；

SSR技术检测到的是一个单一的多等位基因位点；

SSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合和杂合基因型；结果重复性高，稳定可靠；兼具PCR反应的优点，所需DNA量少，对DNA质量要求不高；扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）AFLP（AmplifiedFragmentsLengthPolymorphism）即扩增片段长度多态性，是由Zabeau和Vos（1993）发明的一种利用PCR技术检测DNA多态性的方法。AFLP结合了RFLP的稳定性和PCR技术高效性的特点。AFLP的多态性极高，一次可以检测到100－150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。

AFLP标记的原理

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植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切，其中包括一个酶切位点稀有的内切酶（识别位点一般为6个碱基或8个碱基）和一个酶切位点丰富的内切酶（识别位点一般为4个碱基）的酶切组合，形成分子量大小不等的随机限制性片段。酶切片段先与有共同粘性末端的人工接头（artificialadapter）连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序作为PCR反应的引物结合位点，通过PCR反应把酶切片段扩增，然后将扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，其多态性即以扩增片段的长度不同而被检测出来。CompanyLogoAFLP标记的特点AFLP标记的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多,AFLP标记产生的标记数目是无限的；

AFLP标记多态性远远超过其它分子标记，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点；

AFLP标记多数为显性标记，表现孟德尔遗传；

AFLP标记具有模板用量少的特点，并且对模板浓度变化不明显；

AFLP标记用特定引物扩增，退火温度高，假阳性低；

AFLP技术受专利保护。CompanyLogo

其他种类的分子标记SCARCAPSSTSESTS特点SNPMolecularMarkers重要农艺性状基因定位的原理和方法班级：作物生物技术07—姓名：陈文堂学好：0701103046CompanyLogo基因定位:

将具有某一表现型性状的基因或与基因有关的标记定位在遗传连锁图或相应的染色体上，称作基因定位（或遗传作图）。Cms-CMo17（rf4rf4rf5rf5)×凤可1（Rf4Rf4Rf5Rf5)Cms-CMo17×F1BC1F23:115:1

例：玉米C型胞质雄性不育恢复基因的定位(1)初部定位：构造F2和BC1分离群体如下：可得：玉米C型胞质雄性不育的恢复存在两对重叠恢复主基因，并且是位于两条染色体上。初步定位——BSA分群法

在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与感病），将个体或株系分成两组，然后分别将两组中的个体或株系的DNA混合，形成相对的DNA池。根据亲本与DNA池扩增带型之间的差异，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。

可以推测，这两个DNA池之间除了在目标基因座所在的染色体区域的DNA组成上存在差异之外，来自基因组其它部分的DNA组成是完全相同的，都是该作图群体基因库的一个随机样本。假如电泳结果如下：标记FSP1P212345…

选出与目标性状可能连锁的标记如2、3、4…

将筛选得到标记去跑所有的BC1、F2群体。

可得结果如下：

植株1植株2植株3植株4植株5234…

根据上面的结果将F2当成一个标记，通过软件计算任意两个标记间的交换值，从而确定目标基因所在的染色体。假如在5、9号染色体上：2Rf435号染色体4Rf589号染色体初步定位，将两个基因分开研究其效应

在F3中保存具有Rf4_rf5rf5和rf4fr4Rf5_的植株，利用进等基因系的方法，进行自交、杂交如下：P1(rf4fr4fr5fr5)×P2(Rf4_rf5fr5)F2P1×F1F3P1(rf4fr4fr5fr5)×P2(rf4rf4rRf5_)F2P1×F1F3精细定位利用目标基因区域的已有序列开发如果在5、9号染色体上存在已知序列，可根据已知序列来设计引物进行标记，就可获得目标基因。分子标记技术的发展为作物育种工作注入了新的活力CompanyLogo分子标记在杂种优势研究中的应用分子标记在种子生产中的应用基因聚合MAS分子标记用于转基因作物后代的选择与检测CompanyLogoDream分子标记辅助选择(MAS)1

在一个有100个个体的回交后代群体中，借助100个RFLP标记选择，只需3代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的99.2％，而利用常规回交转育的方法则需要选择7代才能达到，大大缩短了育种时间。基因聚合将多个基因利用分子标记辅助选择的方法，整合到一个新的材料中，从而创造一个含有多个有利基因的新材料或自交系的方法。如：

目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合3分子标记在种子生产中的应用品种鉴定品种保护中