血液分子生物学基因治疗

血液分子生物学基因治疗第一页，共五十八页，编辑于2023年，星期一本章内容提示基因治疗(genetherapy)体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗基因转移方法靶细胞特点、靶细胞种类反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应第二页，共五十八页，编辑于2023年，星期一基因治疗（Genetherapy

）

基因治疗（Genetherapy

）：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。第三页，共五十八页，编辑于2023年，星期一一、基因治疗策略策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：纠正突变基因

在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）第四页，共五十八页，编辑于2023年，星期一2、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。

导入外源正常基因，代替有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）的目的。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。

第五页，共五十八页，编辑于2023年，星期一途径

就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：

1、生殖细胞基因治疗

2、体细胞基因治疗第六页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

1、生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。

第七页，共五十八页，编辑于2023年，星期一但还存在某些问题：（1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；（2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；（3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）第八页，共五十八页，编辑于2023年，星期一2．体细胞基因治疗

somaticcellgenetherapy

将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。第九页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

措施：（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞。第十页，共五十八页，编辑于2023年，星期一存在的问题

对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；随机插入可能引起后代的基因突变。第十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期一二、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤----

目的基因的获得与转移

第十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期一基因治疗首先获得目的基因，通常从基因组中分离

基因克隆↓定位↓表达↓评价表达情况（一）目的基因的获得—

正常基因的分离与克隆第十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（二）外源基因的转移通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。第十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（1）物理方法1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。

瞬间细胞细胞膜核膜通透性增加

高压脉冲

DNA渗入细胞第十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期一2）显微注射法（microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞

第十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期一常用的细胞（1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕动物子宫→胚胎→个体。（2）胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞→基因操作→注射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合个体。

第十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期一用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对DNA大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。第十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期一例：转基因动物的制备

重组基因DNA

微注射（体外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

动物模型：转基因鼠

(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)第十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期一第二十页，共五十八页，编辑于2023年，星期一clonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞第二十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

转基因动物研究大事记

1974年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导入真核细胞。

1981年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。

1982年获得转基因小鼠。

1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。

第二十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期一3）微粒子轰击法

利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径使微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。第二十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（2）化学法磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。第二十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期一磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓

沉淀反应20~30min

↓

细胞在沉淀物中暴露5~24h

方法简单，但转化效率低。第二十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（3）脂质体法（liposome）应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。

DNA细胞融合转化细胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜第二十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（4）同源重组法

同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。

是将外源基因定位导入细胞的染色体上。

单交换

双交换

第二十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期一通过同源重组定点插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位带有珠蛋白基因的质粒

C重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。第二十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（5）病毒介导基因内转移（Viralmediatedtransfer）是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒第二十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期一病毒载体病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因表达水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体；目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。第三十页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

病毒的分类（1995年）*DNA病毒*RNA病毒*逆转录病毒病毒的增殖（复制）*吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。*脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。*生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。*转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质，在细胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。

第三十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

逆转录病毒(RNA)

常用的病毒载体

DNA病毒

1)逆转录病毒（retrovirus）

目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。第三十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期一例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。

Ψ=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。第三十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

逆转录病毒载体构建的技术路线

*

gag,pol,env序列去除，保留LTR和Ψ，使逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。

*在gag,pol,env序列去除的区域，插入目的基因序列和报告基因序列（如GFP)。

*将目的基因、其两端的LTR以及Ψ这一序列插入经改造的质粒内。

*将gag-pol序列插入经改造的质粒

*将env序列插入经改造的质粒第三十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期一质粒

*

是位于细菌内的双链、闭环的DNA分子，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。

*他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。

*质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物等。第三十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

ori5’LTR

Ψ目的基因

标记基因3’LTR抗生素基因第三十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期一第三十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期一逆转录病毒载体优点：①高效感染宿主细胞，转染率可达100%②病毒基因和所载的外源基因都可能表达③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留第三十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期一缺点

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；第三十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期一③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。

根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。第四十页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（6）受体载体转移法将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。重组质粒配体细胞膜复合物第四十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期一（三）靶细胞的选择靶细胞是指接受外源Gene的体细胞选择靶细胞的原则是：1）便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内；3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）；4）易于受外源遗传物质转化。第四十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期一常见的靶细胞外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞——β地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗肝细胞——家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗肌细胞第四十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期一三、基因治疗的现状与前景体细胞基因治疗临床实验已经开始，生殖细胞基因治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：第四十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期一具备下列条件选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，基因的结构和功能。目的基因已克隆，并清楚基因表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。第四十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期一基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。第四十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期一ADA-Gene+vector（逆转录病毒）

重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂

10天

Gene表达

回输患儿体内

1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%

第四十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期一2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。第四十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期一逆转录病毒载体

+FⅨcDNA

重组体

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。第四十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期一3、黑色素瘤的基因治疗肿瘤基因治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞——TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。第五十页，共五十八页，编辑于2023年，星期一例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（肿瘤坏死因子）

逆转录病毒载体导入

TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内

TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。第五十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期一4、自杀基因的基因治疗X

原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。第五十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期一

自杀基因(suicidegene)是一类前体药物转换酶基因，其编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的前体药物在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。目前研究过的自杀基因有十余种，最常用的是HSV-TK/GCV和CD/5-FC两种自杀基因系统。4、自杀基因的基因治疗第五十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期一如：自杀基因+病毒载体

转染重组载体

药物前体无毒Gene→酶→↓

药物复合物有毒

细胞死亡第五十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期一例如：

单纯疱疹病毒

哺乳动物细胞

HSVGene-TK

（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）Gene—TKGCV（胸苷类似物）