第六章微生物与基因工程

第六章

微生物与基因工程微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用！“微生物与基因工程”基因工程（genetic

engineering）或重组DNA技术(recombinant

DNA

technology)是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或

合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生

物表现出新的性状。二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。第一节基因工程概述一、基因工程的基本过程1.基因分离：分别提取供体DNA和载体DNA

b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA体外重组在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和载体连接，成为重组载体。重组载体的传递与筛选用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子.在特定的宿主中表达,得到基因工程产品二、基因工程的发展历史对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：DNA的特异切割DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）DNA的快速测序DNA合成技术聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增）DNA的定位诱变技术微生物学与基因工程的关系1）基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬菌体改造而成；2）基因工程所用工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；3）将外源DNA导入宿主细胞的人工转化方法，是在微生物自然转化现象的基础上发展起来的；4）微生物细胞是基因克隆的重要宿主，5）微生物是基因产物的重要表达载体；6）基因工程得以建立与发展的理论基础主要来自对微生物的研究；7）微生物的多样性，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术第二节微生物与基因工程工具酶基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的一、限制性核酸内切酶（restriction

endonuclease）能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition

enzyme）。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。1.命名与分类取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。EcoRI表示大肠杆菌属名第一个字母E：co：表示种名头两个字母表示株名表示该菌中第一个被分离出来的酶。R：I：根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型I型和III型限制酶无切割特异性或特异性不强II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强。2.

限制性核酸内切酶的基本特性识别序列通常由4～8个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromic

structure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5¢磷酸基和3¢羟基的末端Hind

III的识别序列：5`-A

A

GC

T

T-3`3`-T T

C

G

A

A-5`5`-A3`-T T

C

G

AA

G

C

T

T-3`A-5`切割后形成具有粘性末端（cohesive

end）的DNA片段：限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成5¢或3¢单链突出的粘性末端的DNA限制片段。二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。HpaI的识别序列：5`

-

G

T

T

A

A

C

-

3`3`

-

C

A

A

T

T

G

-

5`5`

-

G

T

T3`

-

C

A

AA

A

C

-

3`T

T

G

-5`切割后形成具有平末端（blunt

end）的DNA片段：限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链。具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的作用连接起来不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。3.同裂酶（Isoschizomers）有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶的反应条件可能存在差异。4.

同尾酶(Isocaudomers)有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。MunI：

5`

-

C

A

A

T

T

G

-

3`3`

-

G

T

T

A

A

C

-

5`EcoRI：

5`

-

G

A

A

T

T

C

-

3`3`

-

C

T

T

A

A

G

-

5`5`

-

C3`

-

G

T

T

A

AA

A

T

T

G

-

3`C

-

5`5`

-

G3`

-

C

T

T

A

AA

A

T

T

C

-

3`G

-

5`重新连接后的序列：5`

-

C

A

A

T

T

C

-

3`3`

-

G

T

T

A

A

G

-

5`二、DNA连接酶（DNA

ligase）T4

DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶在体外将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子三、其它DNA聚合酶：从大肠杆菌中提取，用于体外合成DNA碱性磷酸脂酶：用于DNA连接时对载体的某段末端进行修饰，以减少载体的自身环化核酸外切酶：用于DNA的缺失分析单链核酸内切酶：用于修饰粘性末端及进行DNA结构分析第三节微生物与克隆载体以扩增外源DNA为目的载体------克隆载体（cloning

vector）作为克隆载体的基本：载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制载体应具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入载体必须具有可供选择的遗传标记载体DNA须易于生长和操作基因工程的常用载体：质粒载体λ噬菌体载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体噬菌粒载体真核细胞的克隆载体人工染色体一、质粒克隆载体特点：低分子量有利于DNA的分离和操作；具有较高拷贝数；易于导入细胞；

d）具有安全性；质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb二、λ噬菌体克隆载体将野生型λ噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体

DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区域进行改造。特点：它的分子遗传学背景十分清楚λ噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。 而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100％，而质粒DNA的转化率却只有0.1％。和质粒相比，λ噬菌体具有更为狭窄的寄主范围，因此更加安全与溶原性相关的基因可以被外源DNA取代而不影响λ噬菌体的感染、复制和裂解宿主细胞的能力。经过体外基因操作和包装后形成重组噬菌体，可以通过正常的感染途径进入宿主细胞；重组噬菌体DNA也可不经过体外包装而直接通过转染（转化）方式进入宿主细胞；质粒和噬菌体载体都可用于构建基因文库；但后者更有优势：容纳的外源DNA片段较大；以感染途径进入宿主细胞的效率比转化高；三、柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmid

vector），又称粘粒，是由λ

噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。Cosmid(cos

site-carrying

plasmid)带有粘性末端位点(cos)的质粒特点：具有λ噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照λ噬菌体DNA的方式环化，但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。具有质粒载体的特性：在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。具有高容量的克隆能力：柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力。同时，由于包装限制，柯斯质粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。例如，5

kb大小的柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于30

kb。柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，而这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。四、M13噬菌体载体M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp生活史：通过性毛感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞进入细胞后，转变成复制型(RF)dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。M13克隆载体是对野生型M13进行改造后建成，其特点是虽然克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300～400bp的外源DNA片段，但特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针，进行定位诱变等，也可用于噬菌体展示（phage

display）。五、噬菌粒载体丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点。五、噬菌粒载体六、真核生物的克隆载体真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，单用原核生物载体所很难解决现在常用的真核生物载体，主要有以下二大类：酵母质粒载体真核生物病毒载体六、人工染色体酵母人工染色体（yeast

artificial

chromosome,

YAC）细菌人工染色体（bacteria

artificial

chromosome,

BAC）人工染色体的最大特点是克隆外源DNA能力非常大，例如一个

YAC可插入长达1000

kb以上DNA片段，BAC的外源DNA插入量

为300kb，特别适合于对结构复杂的高等生物的基因组进行分析，在人类基因组研究中正被广泛应用。第四节微生物作为克隆载体的宿主一、宿主的基本要求与性质①能够高效吸收外源DNA；②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；③不具有限制修饰系统；④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）；⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。二、常用的基因工程宿主1）大肠杆菌枯草芽孢杆菌酿酒酵母特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚4）动物细胞四、外源DNA导如入宿主细胞

五、基因文库与cDNA文库的构建六、重组体的筛选与鉴定自学！第五节基因工程的常用技术和方法一、PCR的原理和应用聚合酶链式反应（polymerase

chain reaction,

PCR）1．原理特点：在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程（Mullis，1984）（1）变性