猪链球菌病诊断课件

第八讲猪链球菌病诊断猪链球菌病：是由致病性猪源链球菌感染引起的猪疫病的总称。猪链球菌病的临床表现主要是败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎。

OIE列为B类传染病病原：1猪链球菌2型（Streptococcussuis2）2马链球菌兽疫亚种（Streptococcusequi

subspzooepidemicus)，旧称兽疫链球菌3D、E、L、S群链球菌(Lancefield)兰氏血清学分群，链球菌分为20个血清群（A、B、C.....V,I、J除外）一、病原分离1采样活猪：采样用灭菌棉拭子擦拭扁桃体病死猪：扁桃体、肺、肝、血液，有脑炎症状取脑组织，关节炎可取关节囊液2分离培养（1）培养基：THB培养基、绵羊血或马血平板（2）培养条件：需氧兼性厌氧、37℃、pH7.2

猪链球菌2性营养要求比马链球菌兽疫亚种低，后者需加3-5%的犊牛血清二、临床诊断

主要表现为败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎等。但不同链球菌病原引起的症状类似，故该诊断不能用于确诊。关节炎症状败血症1染色镜检猪链球菌2型：革兰氏染色阳性、菌体呈圆形或椭圆形，直径小于2.0μm，一般呈短链或成双排列，革兰氏染色阳性，菌体表面能形成荚膜。

二、微生物学诊断马链球菌兽疫亚种：

革兰氏阳性球菌，直径0.5~1um，液体培养基中呈长链，菌体表面能形成荚膜。营养要求较高，在5%犊牛血清生长良好。根据类M蛋白抗原性的差异，该菌至少有15个血清型。马链球菌兽疫亚种猪链球菌2型菌（α溶血）图2猪链球菌2型

(ZY05719)

ATCC35246株2培养特性猪链球菌2型：

菌落形态血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，2型在绵羊血平板上呈α溶血，马血平板则呈β溶血。马链球菌兽疫亚种：在血清肉汤培养基中培养该菌，开始时有轻度混浊，继而变清，于管底形成沉淀。于5％绵羊血琼脂（THA）培养基上培养24h，大部分菌株形成3～4mm的粘液样大菌落，产生明显的β溶血。小部分呈非粘液样菌落，大小约1mm左右。3生化鉴定猪链球菌2型：

发酵乳糖、海藻糖、水扬苷，部分菌株发酵棉实糖、菊糖；不发酵甘露醇、山梨醇马链球菌兽疫亚种：能水解精氨酸，发酵乳糖、水扬苷、山梨醇产酸。不能发酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。V-P试验阴性，不产生靛基质，不还原硝酸盐，不液化明胶。三、免疫学诊断1玻板凝集实验用于猪链球菌2型快速定型，但要求抗体效价高；马链球菌兽疫亚种只能用于定群

2乳胶凝集实验敏感性较高，结果容易判断，但有非特异性3免疫荧光猪链球菌2型：用MRP特异抗体可用于菌体表面其分布的观察，但需用激光共聚焦显微镜。马链球菌兽疫亚种：用类M蛋白特异抗体可用于菌体表面其分布的观察MRP单抗介导FITC标记SS2表面MRP的激光共聚焦图像

MRP单抗介导FITC标记SS2表面MRP的激光共聚焦图像

SS2多抗介导FITC标记的SS2的激光共聚焦图像

ELISA

常用链球菌多克隆抗体包被，以MRP或类M蛋白的单克隆抗体夹心，敏感性高，特异性较强。四、分子诊断1多酶电泳法：原理：不同型猪链球菌，胞内酶分子的氨基酸有差异，因而电荷有差异，在电场中，其迁移率有差异。用于不同型链球菌的分析2限制性酶切图谱分析

原理：不同种或亚种链球菌基因不同，因而用限制性内切酶酶切后，其电泳图谱不同。用于分离株变异分析，亦可用于不同种或型的鉴定随机扩增多态DNA分析（RAPD）用多对随机引物进行PCR扩增，可得到不同的产物，且产物具有多态性。可用于种或型的鉴定或分离株变异分析PCR猪链球菌2型：

mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作为靶基因进行检测

cps2具有型特异性bp970744622557mrp,ef,sly,CPS2123451:HA9801;2:ZY05719;3:Marker;4,5:阴性对照250bp500bp750bpM122000bp1000bpMaker1.HA9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2250bp500bp750bp2000bpM1234ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626bp)2.mrp(316bp)3.gdh(688bp)4.orf2(858bp).250bp500bp750bp1000bp2000bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1099bp1310bpM1M1slyfbpsMaker1.slyMaker1.fbps1040bp100bp250bp500bp750bp1000bp2000bpM123M:DL-Marker20001:ZY05719(gapdh)2:HA9801(gapdh)3:空白对照gapdh图8orf2PCR检测结果1marker;2~4,7~13PCRproductsofswineStreptococcus,2HA9801;5~6negativecontrol图11PCR检测猪链球菌2型cps21.H2O;2.SH0033;3.35246;4.ZY05722;5.ZG05464;6.GH05458;7.HA9802;.8.ZY05719;9.HA9801;10.YJ05465;11.JDZ05802-1;12.JR05730;13.ZY05721;14.11611;15.CHZ05806;16.260;M.MarkerDL2000.bp387M1615141312111098765432110025020007501234562000→1000→750→500→250→100→1DL2000market2、3PCRproductofATCC35246