第十二章体外试验与生物新技术

第十二章体外试验与生物新技术在毒理学中的应用体外试验毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。过去利用整体实验动物模型或称体内试验(invivotest)模型所提供的资料，判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(invitrotest)在上述过程中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的重要方向是体外试验。②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。一、概述(一)分类毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。在有些情况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：①筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。(二)基本原理体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或DNA分子等等。(三)体外试验的优缺点体外毒性试验的优点可归纳在表12—1。表12-1体外毒性试验系统的优点能控制环境因素可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等试验间的误差较少种可同鸣时和蕉／或中反复桥多次挂取样建可做兆成复玻杂的岸互相李作用调的试残验系译统，尤如复羽合细钞胞培秋养等跑较为乘快速征和经锯济杀需要裤较小遍量的布受试即化合快物促产生她较小胸量的任有毒侍废物恼可以督利用恩人体弟细胞裂减少梅整体压动物呈的使鹊用甩沟景其中钥特别虑值得前一提卫的优泳点是咬体外浙试验川的简像便和确易于问利用悉人体币细胞避。体深外毒发性试职验结殿果可工迅速崖得出帐，将粱减少蛇了解仓新化民学物颂毒理骄学资吊料所奉需的肝时间标，最抬终可乎以缩聚短从被新化亩学物鬼的合总成到停产品透进人元市场鸣的时逐间过竭程。跑此外归，对活鉴定辩毒理典学资叔料有罩问题援的新屈化学命物，圈可及竹时终暗止开尤发，袄减少西由资处源到陪产品秆的投骂入。船在毒澡理学赔整体热试验躺中禁穴止直耍接进捕行人验体试陕验。他但毒艘理学尺试验桐的目占的是涨关心婶人类悦健康艇，目掉前主惨要是齐将动纵物试慈验结怎果外脏推至受人类毅，物册种间放差异仆为其圣不确拦定因递素之庭一。跳在体庸外试证验中疲，利次用人止体细狸胞组樱织进廊行试库验，欢可较棕好地估解决耀物种竞差异洁的问迈题。讨腰艺体外许毒性硬试验兽系统匆的利灵用在标目前税尚有斥不足缓之处旨：森①傻体外衔到体桂内外谨推的厦问题塑。体碑外试很验是史依据定毒性幻作用执的始乱发阶质段及肾继续魄发生采的分叨子与住细胞己反应铺，其店与整盘体系那统有板差异赚，如融何将屋产生信体外财毒性币的体略外浓乔度与低相应涨体内狠剂量彩联系汽的问煤题是名最终德未解嘉决的汪难题梁。它肢需要地更好袍的工节具缎——踢预测击性毒夸物代怠谢动其力学介来解扁决，更其关纱键在许于发掏展有丙生理尊学基定础的秆毒物自代谢甚动力男学模颗型。按另一戏方面稠，体挪外毒坊性试惩验中奇缺乏编毒理慢学反蝶应的俊调控总因素氧，如反细胞舍与组榜织的射修复弄过程乓和免炕疫系并统的汉不同梨类型牺细胞康间的刑相互颤影响纳等。续假如却有了野更全愈面的浩毒理系学过发程的劳基础鄙知识掘，可雨设计笨更符毫合整芳体动烛物模聪型的磁体外箩系统铸。但扑现阶迈段毒庄理学较作为督一个述学科溪的发收展尚绝缺少细许多随重要灰的资耕料。济②旧体外帅毒性配试验嫌难以居预测南慢性怜毒性出。因亲为，丛慢性扮毒性业病理便过程阻的机命理所被知甚曲少，物缺乏鉴发展堆体外剃试验胀的理割论依筋据，积再者纺，某训些体萌外系劫统仍惊难以毅达到殿长期诞维持技生理午状态特的要规求。景誉二、程体外截试验增系统航瓶切(一口)库脏器伐灌流虫暖奸1.贿肝肢脏灌仰流拾是垃毒理煎学中荷研究保外源贩化合趟物对斜肝脏梯损伤睡及代雄谢的同常见皂方法碗。在阵灌流泪液中贵加入抵外源朝化学津物，火此外歪要维取持灌速流液岁的p位H值证、氧葱含量何，还躺要控沃制适辩宜的知灌流维液流干速。罢一般震是以冶下腔全静脉碰和门咬静脉偿为插校管灌望流通祥路，驴为此炎应结宋扎肝怀动脉炉、上愤腔静贴脉，根在恒宿温条锻件下垫灌流膀。有骗报道想用肝袜灌流村方法参研究挡四氯忘化碳造及其相氢取栏代衍谁生物伏三氯贴甲烷税与二武氯甲智烷对知肝脏宋毒性雕，结嫁果发伸现随挂着灌广流时貌间延类长(违在4辆h之吨内)煤，灌毒流液装的上练清液延中K仪+款、谷桌丙转赞氨酶杨(S握CP副T)种、山籍梨醇它脱氢拉酶(范SD集H)促、谷讨氨酸只脱氢乳酶(扎GD莫H)国增加圆，说王明三笔种化栏合物剖对肝轻细胞红均有至损伤欺，而缺以四绞氯化棉碳为干最，赞且依擦氯原遭子被盲氢取设代肝忽毒减龄低。枝需指急出肝这灌流火时间盼不能盐过久翻，以性4h裕之内天为宜食，否于则肝敌细胞驶的功灰能与卡生存推不能爆维持众。残办抵2.忽肠梁灌流喘久利用涝某一躁部分丧小肠弹体外霜灌流劫可以啦研究禾一些事化合晴物的尼吸收递及动港力学胃过程营。如槽用大思鼠，豆则在侦麻醉位下切偏腹分闷离一妈段小您肠，摘在保掌持原握有血写液循炕环体朋系下逐，将佩肠两去端插难管，特清洗钱净肠棍中内定容物后，在诸恒温纷环境榴中灌叔入灌期流液涂。例况如有干人研丑究锌捉的吸厚收及崖其影戴响因圾素，督以大控鼠回低肠段唤为标扩本，负证实则锌吸腥收呈也二室与模型菜(肠振腔为替Ⅰ貌室、渣肠粘染膜为余Ⅱ怪室)安，苯坟丙氨修酸能百增加泊肠腔祖与肠铸粘膜谣之间四锌的撕交换扇，且扩加速沿向血且流的仰清除至过程躁。勉计旗悔3.解膈岛肌-投膈神冰经标弟本般取讽完整芬的大腥鼠膈乔肌-谦膈神途经置咸于恒崖温灌逢流液纤中，所，在伟几小锋时之说内可育青凶跌佛衬谣百境湿熔膀快公尽正都瘦贩弄判贪行迹(二只)剑脏器惩切片疫晃骡肝脏红、肾莲脏、直脑部溉及心脾均可侦以制辰备切梁片。然例如致，脑浑片和停心肌纵条等诊是将棋组织卧片置冤于恒门温的敲孵育象液中面进行计有关覆试验哪研究阁，但喷需注滨意切温片中亲的细脉胞需慢保持抽完好听的细球胞基睬质和料细胞圾之间垃的交拆流。很切片之厚度店一般吧在2撞50恐μ盲m。耕不同气研究劈期间免有别左，如沿肝切寒片研骗究C躬yt北P-芽45栋0不价应超团过8嗓h，吼脑切劣片一占般在冠6h皮左右扛。此盟系统柜的优寇点是秤保持断了细隶胞之援间的耻结构失，其在操作孝也比赛脏器教灌流嫩容易葵。不叫足之朗处是样切片炭内的绍细胞和易于娃缺氧戒，且盲受试盗物也巧不易渐均匀冻到达套细胞咬内。瓜照趋(三达)达原代惧细胞绝培养背剑1.栋肝脚细胞羞原代影培养方堂肝细丧胞尚掉未建馋成传宝代的抛细胞农株系退，多绸用原伤代培伍养。泻肝细矿胞原突代培嫩养期宇间细喷胞不铅分裂举、不篮增殖嗓，但扫发现竟基因左转录逝是存颂在的犁(培昼养初决期2饼4h喝在1樱％或堡以上脏)。资细胞括原代强培养突维持件生存瓶期1唇～2讨周，袄但是泼Cy芝tP姿-4摄50治却在岂24控～2薄8h逆活性致减少搂50推％左码右。椅据报总道人乖肝细捡胞中赖Cy森tP润-4纯50捉活性汪稳定鲜性比尽大鼠瞎强。迷宰禽利用砖原代艳培养识的肝豪细胞伤可以罢进行监多种齿毒理继学研乌究。展如研那究化塞学物霜的肝磁脏毒厕性，进一般珍认为坐，用礼原代凉肝细鸟胞培锐养筛饿检与量鉴定仅是否盼化学队物具堡有肝绑脏毒岭性较谈为可轮靠，径与体葱内试纲验相泡符合丢。有萌报道熊以肝合细胞财损伤伐后某嘴些酶油释放谅为指扶征，套研究卷30魔个化亩学物袜，结孙果除夕少数买化学时物在盟肝细眼胞培叹养中肆表现诵毒性搭比体罢内试愧验低五之外旦，多楼数化边学物耻内外顶毒性卖符合贱一致兰。在砍体外式试验谦表现枣毒性掉较低枕的化锤学物韵有环王已酰猴胺(录cy剂cl周oh惜ex拒im重io昂le狸)、惨溴苯离(b赏ro油mo沃be外nz皇en烫e)淡和长眉春新宁碱(秩vi芹nc详ri娘st订in撒e)块等。票鸭威纱荒2.积巨梳噬细挖胞递豚吓鼠或坏大鼠精都可削以肺糊灌洗古方法它获取路肺巨嘴噬细漫胞，锹小鼠脚可用佣腹腔妹灌洗包获得渴腹腔望巨噬魄细胞筐，甚滨至人相也可式通过端肺灌债洗得掌到。届巨噬颗细胞珍可以及用于灿多种岗体外锡试验笨，例愉如利赢用巨炼噬细胞胞的轰免疫冤功能名检测杠外源霜化学嫁物的膜免疫浑毒性着，又倒如利签用巨煤噬细抽胞检商测以感肺脏恐为毒仰理学卸终点页的外粒源化拾学物焦的中准毒毒里性和枪机理槐。关锤于后碗者，威有人牵利用罪豚鼠驴肺巨籍噬细舌胞原畏代培掌养纯昏化后未，研趣究二针氧化能硅(予si秤li办ca似，S搅iO盟2舟)致扛矽肺卖的机充理。偿张冬殖屿3.拥淋孤巴细围胞歇多假用小答动脉龟脾脏连分离躬淋巴盖细胞出或进再一步争分离师T、灵B淋盖巴细柳胞进右行免桂疫毒椒理研低究。楚例如花研究距镉的联免疫斩毒性汗，证骡明镉大可以棒抑制巧淋巴厘细胞疼转化姜和抑汪制白青细胞台介素南-2锄的产餐生，盘且在堵一定拆条件标下使摄淋巴若细胞存内游纵离钙环浓度踢增加繁及钙壶调素骆(C姓aM陪)活铃性降粒低，岸此为其镉的炼免疫确毒性攀机理需研究撕提供尽了线僻索。梯兴氏4.灯脑婆细胞序遗分离刘的新泡鲜脑零细胞蛾有助穗于研屈究外苹源化舒学物仿对神独经系毅统损挽伤的昏评价也与探貌讨其厨机理吼如用给小鼠咳大脑攀皮质奴分离恨、温喝育后研，研滚究二途价阳佳离子陵钙、琴镁、伍锌、拌镉等齿对皮胞层神到经细当胞的子损伤依，发壤现这痕些离兔子随漏着浓衫度的栏增加严，脑早神经姥细胞棕的电扫泳迁和移率飘逐渐弄减慢狡。灶赚苏随着伴脑细材胞技晒术的观发展货，还盗可在银温育奉体系呢中存备在外逐源化专学物病情况撑下，刺用微嫩电极颤插入筋脑细贪胞，敲通过靠电信芒号的失变化配，更渐深入旬地研障究外撕源化妖学物磁对神姑经细排胞的涉功能伐损伤窑。饱暂喊5.碌心迹肌细吵胞僻心欺肌细旋胞用票于毒迫理学刻研究奥的报张道目症前还身较少事。用永新生兴1～耍2日忧龄大础鼠心刃室肌妻分离先心肌阁细胞掏，原仓代培尽养4社天后累，将柄微电路极(贤直径吗<0小.5例um凯)插哑入细纲胞内可，研奉究镉腰对心禽肌的驾影响瞎。经降记录惨、分减析各鸟心肌山细胞猪动作槐电位搬参数糠，结宫果镉喇在5伞～2材0蹦μ垒mo冈l／付L浓翁度下亲，可锄使心味肌细围胞动火作电和位及帜最大轮除极慨速率凤显著拍降低应，表百明镉筋对心亮肌有肢直接将的毒县性效由应。斧杰拔此外绳，将电分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细胞需的一乳般毒晨作用槽和正捎在分滋裂组蛙织的犬毒作自用；奏二是环利用剂已高蒜度分火化的恳细胞钩，无混论是缴原代饰培养查或是乖特定蹈的细尺胞株曾，研头究受展试物惊对已肥分化某成熟衡的细击胞或梅其功忠能的夸特殊钉毒作卸用；搁尖逗二、建基本策技术亚仪器年与设务备蔽搏1.银培升养箱字蚀一般听来说迟，在烦5％熔CO尾2甩，9亿5％率空气修和9竖9％障的相为对湿茎度的片条件阶下，选许多垃细胞畏可存凉活。睬故细砖胞培酒养的子关键直设备丰是C奥O婶2础培养种箱。做其基迅本要踪求：可①预精确胆地温困度控够制调览节，展一般满在土眉0.帮5杜℃狸，箱裳内温究度的揉均衡袍可依券赖风额扇；盐②叠CO躁2佣浓度讲调节弹，利垦用C迫O泪2薪传感警器监骄测箱多内C猪O立2痛浓度妻；使必箱内啄大气眠为5威％C数O乳2疾，9存5％海空气泡；珠③唯箱内姑湿度雅，可窑用水则盘来调维持挖。有识的细棕胞培衫养可棚以不走控制絮CO安2图分压订。例浑如，掏原代仗肝细资胞培阵养，狸可用偷Le珠ib询ov院it病zL刃-5级介质森，不理需C镜O薄2府，而盏要求搁敞开不培养剃瓶，呀以供佛给较委高的灵O柿2正分压陷。弓尝维2.蚊冰排箱和增冷柜卷笼冰箱授(由4庭℃诸)用框于存谋放培抛养介盒质，匀冷柜卫(矿—殃20欠℃丽)则吐存放导酶，私(如继胰蛋醒白酶莫)和透某些速培养狂介质瞎如谷障氨酸剩和血趴清。影怪烈3.蜜显腾微镜延灾最基慌本的搅配置秩是一脉台简葬单的倘倒置面显微犹镜，完用作怕日常装观察别培养辫中的改细胞雾，以减便依求据细德胞生直长状窄况，坊进行陶调整终或对流污染耀进行艺补救庆或处源理。誉进行守进一珍步的呈研究苍，则得需要饿更高辫级的繁显微旬镜，创例如森，相呜差显泼微镜紫或荧宁光显惰微镜苦，并堪附有遭照相携装置拣或摄植影装征置。存股模能周4.绒超既净工领作台这煮在没心有无罚菌操喜作室巡的条漆件下诊；可羊用超川净工叹作台低。它忘是一广无菌贞操作疏装置香，主充要是姿利用椅鼓风梢机，酸驱动趴空气并通过结高效叙滤膜涂净化易后，盐缓缓盐通过企工作照台面号，使朵工作剪部位旅构成酿无菌困环境络。它摔具有拔占地资面积无小，挠操作侵方便貌等优游点，悦但它化尚难钞绝对邮除去绑病毒贯类微狸生物煌，而天且灰宝尘过默多对痒净化英作用动不利利，故漫超净巡工作荐台最栗好安安置在式清洁剧无尘闯的房茄间。粗粘爪超解5.飘清山洗和查消毒疑设置牌：培悲养中稿所用极玻璃潜器皿疾可用眯电热芒干燥龙箱消庸毒，挥要求该温度条16股0件℃雁以上惩，最微好使猜用较侵大规左格的谎干燥所箱，饰如6洽50趣×汁50艘0拣×刮50若0m与m推。鸡对王器皿僚的清熄洗可偏用超反声波贞洗涤漂器。栗吸管组的清局洗采衡用虹耐吸原作理制军成的评冲洗顿装置盈。金位属器剖械如没解剖芦刀、插虹膜猜剪、愤镊子眉、尖岔镊、擦止血猫钳等昏可用筑高压单蒸汽肯消毒目。第因曾6.泡培胁养器裂皿疏为牌了清哑洗的睁方便帝，塑孙料瓶雨皿正抚逐步撇取代发玻璃奔瓶皿葬。特男制的郑塑料鹊瓶皿俱具有废透明伸、平祥滑、夺无毒杆性、墙有利梯于细滑胞生纳长的杀优点喜。主民要的秤塑料天瓶皿枯有；使①榴多孔排培养显板，清其规溪格有灿4孔蒸、6壶孔、跑24乎孔及笑96考孔，秘它体悼积小刻，适悬于少谈量细其胞或伞单个沟细胞棒克隆妖的生是长；抽②结培养侨皿，糟规格受有直握径贞30阻mm迷、丽60墨mm首及l益00写mm逆，与聪玻璃捞培养说皿相某同，政尤其常有利苏于集秀落形扶成和即细胞陡转化冠等试岗验；榴③退培养菊瓶，苗带有拴螺旋其盖塞莫，规肠格有编30搏ml注、5厅0m步l、遇l0疏0m欣l及猾50氏0m槽l，吩适于蜻在C围O偷2糖培养召箱中惭使用喂；滥④粪其它把：冻裤存细辉胞的喝塑料斧安瓿市及微版量加透样器棵头，热后者监的规畅格有带20那0~没10总00骆μ讲1和律1协μ叹l~贯10尘0厕μ奋l二桨种。女蜻往脊旬玻璃涉器皿榜在实肃验室凉仍不扁能完视全被湾塑料格制品岩取代雄，除责培养水皿和看培养金瓶外吹，主果要还握有：遮①讽吸管堡，它需包括沙刻度球吸管顷和移纪液管勒，常艳用规枪格有已l0耍ml层，5粱ml吩和l姓ml估；淡②挠玻璃示瓶，罪用于咏配制峰各种粉培养捐液的提储贮券存液出和血刺清等犬，可轨用生经理盐左水瓶辞或血辛浆瓶鼠代替晌，规墙格有案50想0m眼l、承25葱0m挎l和杠l0旗0m绑l；怀③撑离心杀管，硬规格欲有5泛0m仗l、火l0辟ml涝和5厘ml喂，用视于细钱胞洗桥涤。韵药捎7.历液锐氮贮垃存器只鸟贮存墨细胞分多用岁液氮考，液紧氮温旺度在铁-1衡96海℃招，具亚有经枣济、食省力抹和能灵较好螺保持俊细胞灭生物紫学特刷性的求优点斯。液详氮贮枝存器虎有紧25呜L分和幕50灭L雪两种低规格臣，它愧与液遭氮运甚输瓶歉，或会称杜斩瓦瓶筛不同次，因梁液氮饿贮存维器一算般每耗两周早需补曲充一侵次液练氮。汁如有脉需要根可配扯置贮漂存器路和运段输瓶叨。塑妈栋8.垃水英纯化肆装置耐暑细胞藏培养洋对水过的要黎求较录高，谢通常定要求冒使用返三次轻蒸馏或水配夸制各傲种培侦养液灯。对克玻璃三器皿煎也应持用纯锣水清肃洗。侄但是页，在硬细胞苗培养晃中，岁不宜增使用诸去离条子纯开水，敢因其怨不能蓝有效刺地去夏除有扰机物神。剂交唇实验谅室应希配备拢自动葬加水奏石英生玻璃寇管加女热的臣蒸馏因器，学具有刷蒸馏就速度脚快，碰使用曾安全状等优爪点。垂外购柏蒸馏胃水或避去离搂子，通应在艳本实根验室宜重蒸拿后使肥用。紧对水悟质量委应经齐常检妨测，浇如p字H和巾电导姨系数宜。同迫一实币验尽糊量使泄用同澡一水祖源，魔避免子水质勒量造钳成结贯果的字差异初。趋昂跃漏冠9.糟滤净过消荡毒装舅置棚培掏养介河质不劈能经库高压毁蒸汽环消毒剑，而易需通逼过孔则径为抬0.盟22季μ背l的狭滤膜影过滤祸消毒虾。滤链过消拥毒装争置由状抽气使泵(个水流株玻璃矩抽气隶泵或进真空督泵)绍、安驾全瓶删、抽糖滤瓶凶和滤破器组脊成。俗10幻.帅一般合设备前必离心虚机，贸用于益对细状胞悬缩液离讨心处能理，圾以达亚到细挠胞洗屈涤、辽调节榆细胞缩浓度尘等。疗炮摆天平握，包带括普络通台坝秤、汽扭力付天平吹和分悬析天裙平，颈用于起配制波各种堪培养叶液、虏酶消春化液鱼及生破理盐膛水等气。妙唉叠匆升酸度槐计，蜻用于眠准确辰调整比各种雨介质扣及生胖理盐朝水的讯pH络。湖帜盈电磁匹搅拌悄器，比微量狡加样胞器等惯。毕诊呼(二兴)营培养闸用液叹湿燃指细孙胞培响养中柔所使截用的欢溶液扭，如递培养更液、右消化祥液、摸pH省调整遣液、泥染液炮及细治胞洗斥涤液谱等。册培养康液的激选择膏取决答于细彼胞生系长的阴要求衔，故俭它是孙维持清细胞演生存方和生砌长所征需的覆基本技溶液裕，它需的主任要成直分为彼平衡届盐溶墨液和谢适应润细胞辛体外车培养接的各脉种溶巷液。普涌面件穷培养衬液在挤制备毁过程富中应咽严格笔操作喝，避芝免混央入杂戴质。穗应特万别注晴意下凶列问疼题：热①耍容器今，应挖仔细疫认真伏清洗万，必块要时久须消溪毒；于②章水，英三次舒重蒸凯蒸馏爆水；促③缓严格稿选择谅品质免优良好的药镰品；信④晋制备掩好的艰培养痛介质抢要标豆明名羞称、挠配制支日期历及配系制者与；焰⑤躺贮存勺与消钉毒。生袋绩鸣猾1.霉平规衡盐场溶液最筑常用住的有驴Ha支nk骂s液疲、E搞ag低le燥液及维磷酸低盐缓尚冲液屠(嫩PB老S)鲁等。运它具激有维咐持渗感透压哥、控葛制酸扩碱度允平衡疫的作吉用及洪供给营细胞冷生存及所需独的能谢量和舟无机躬盐的留成分徒。它首是配南制各存种培价养介免质的释基础攀溶液报，也淹是洗挎涤细忧胞的梳溶液故。唐滋铲纲为2.胀小翼牛血吨清生是才细胞彼培养床中最摘常见邪的天还然培蓄养基执，它隐具有袜丰富赵的营吼养物连质，端对细限胞附炸着和删保护蜻也有雨明显黑的作约用。廊但它驴有成魄分较老为复续杂、特个体葵差异取较大慌、来巷源也不有一握定的宵限制耽等不驻足。哥弥补惹个体岩差异砌的办念法是历对血仍清进粘行无辉菌检德测和献支持梁生长秋能力疲测定腾后，慌混合刃使用丰。天情然培真养基筑除小碑牛血萌清外皇，还堂有鸡园血浆则、鸡喘胚浸法出液求、水攻解乳市蛋白掉和鼠需尾胶兆原等向。臭佳需3.寿合归成培棉养基桃施系依建据天旅然培小养基丑的成待分，项用化考学物莫质模腊拟合驱成的妹。如概最简遍单的包ME成M嫌Ea翁gl神e培巾养液奴，包辛括1疏2种究必需愧氨基弟酸、誉谷氨插酸胺夫和8悬种维恐生素科。根址据需留要可界添加越某些紫成分半，如赠碳水哨化合河物(斜葡萄袖糖、忠核糖版、脱坟氧核泡糖及聋丙酮纠酸钠这等)层、核巷酸的否前体壶物(泻嘌呤划和嘧遇啶类梨化合抛物)孝及氧济化还肯原剂柔，抗母坏血馅酸、膏谷胱烟甘肽违等。姻怨则如进异行无轰血清计培养刻，除乘上述贫营养贸成分申外，命还应圾加入量纤维垄连结估素、殊多聚愚赖氨淹酸和帜胶原散等成宾分以车促进颗细胞台贴壁助。有遮时，骡还需温要加草入酶供的抑绒制剂驾，如蛛大豆蜡胰酶针抑制离剂。虾乏难为了亚防止嫌由于命操作奉不慎谎所致喉的污旅染，柜可加俱入抗傅生素季。常得用抗仇生素劈有青馋霉素忙、链告霉素约及庆端大霉棚素等湖。仿趋朋4.顾消忌化液胀纸进行嘴传代叨细胞警培养打时，忽为了贸使细即胞脱鸭离生喂长表虫面和瓜细胞弃离散膝成单兴个细欧胞，柄通常旋使用伟消化姑液。圆常用喜的消锦化液原有胰财蛋白逮溶液饭(0款.2梳5％唯或0害.1电25猾％)疫和乙本二胺枕四乙谁酸二短钠(挨Na骡2让-E亮DT揭A)需溶液数(0跟.0语2％壳)。正墓渐四身5.迈其案它缸p劫H调姨整液萍，为宣了营过养成景分稳凯定和外延长示贮存仓时间堪，配悟制生炸理盐悟溶液起，和吗培养寿液时禽，均绿在临凉用前却加入唤Na渣HC朋O晃3绸溶液窗。常点用浓种度有女3.鼠7％问、5基.6叔％和络7.地4%抢。此柳外，缝还有剑HE伸PE黄S溶矮液，帐是一剂种氢永离子鹊缓冲精剂，馆能较否长时宁间保岂持恒拆定的虎pH寒值范硬围。理使用摧终浓露度为手10阿～1徒5m确mo播l／迟L。宁店霉染色慨液：房常用巨的有艇①誉苏木姥精-世伊红别染色叼液或兽称H倾.E面染色应；诞②个Gi脉em用sa令染色你液。床本插固定栗液：繁常用固的有骑①众中性坛缓冲家福尔锤马林朋，相或当于围10读％的有福尔叛马林丝；离②象Bo滨ui至n氏责固定革液；威③风醋酸乓甲醇到，临百用前弦配制盘，结逢合G课ie拆ms三a染徒色效沉果较反好；订④淘FA饿A固棵定液翁，由敢福尔吗马林绍、冰耕醋酸驱及8炉0％刑酒精绒组成徒，用膨于盖章片单质层培库养的械固定队。饿爪溪(三态)去消毒忆技术异乡饥在细茶胞培虏养中殃，消夫毒是裳最基愉本的较一项硬工作右，它养直接出影响秘实验节的结匀果。财消毒摇措施沟应在船细胞抛培养闯的每怜个环馋节严用格执特行。同细胞兔培养折的微评生物害污染隔，包楚括细园菌、继真菌睡及病双毒，跌它们速主要躺来源批于：书操作惧者的这粗心激；操谋作表嘱面或伟周围疮的环熔境；它培养群液及锣培养钟器皿挠的灭爽菌不融彻底饶或存岂放时斗间过霜久等匠。颗榴赖对不绵同的圆细胞蜜培养茂所用赴物品牺，可财采用处不同专的消仰毒灭奉菌的侧方法清。一劣般有地两类临：一征是物聋理灭睛菌法握，即构利用百紫外末线、喉干热凡及微扁孔过凑滤等通；二拜是化裕学灭盏菌法碍，即伟利用悦化学轮消毒亿剂。朽主要您消毒程方面围法介中绍如舱下：手斧剧1.蔬紫勤外线哄季适于柱消毒蓄空气捧、操汁作表考面及隶一些忽不宜储用其炉它方险法消棋毒的榜物品纪和培辞养板悔等，枣使用出方便侦，效作果较沃好。幻应注瞎意其君可产挠生臭锅氧，康影响垄健康组。壤犬津登燃2.遇高它压蒸倍气消靠毒垮它屈适于单金属策器械萄、胶俩塞、型布类续及某晨些培秧养液赚。一仁般要庄求躬15乖磅页压力撞下2怠0m偏in忘。或辫者更苦简单两的，翻煮沸稀消毒稿，其弄不足尸是湿遮度大端，不沿易久董存。绪笑宾3.尤干遥热消筐毒唇适嚷于玻含璃器唯皿，恐消毒杂后器杠皿保最持干塌燥并籍便于级使用月贮存晋。加船温应姜到等16商0壶℃萝，保搁持9筹0-始12莫0m蒜in阳。钞黎预4.惧滤士过消吼毒射适谜于大忽多数裕培养球用液没。选置择孔婶径为蓬0.节22馒μ象m的竿微孔栏滤膜押，过陕滤除道菌效汪果较熟佳。缺贡隐5.岭消升毒剂条促适于额操作摧者的累皮肤胁、操横作表第面和立台面尾、桌扑椅及典墙壁恒等，愁常用臭的消悼毒剂毒有来绒苏儿凤、新扣洁尔模灭、宾过氧键乙酸右及7惰0％真酒精栗。仓三、流培养烫细胞遣的鉴猛定滴督热临汽对培嗽养细鞠胞的浴鉴定芽有两秀个目解的：疾一是扭观察省培养锣有无收变化阁，以许决定屈是否符终止叫培养找，并怕从冷肢冻贮派存的错样品扒重新丰建立诸新的孩培养猛细胞丈；二洁是培单养条拿件(中如培搭养液脾)变省化，题对培炒养细猪胞的路影响谈。因辨为培给养条驴件的搁一致菠性，别对于波实验辆结果家的可先信性推有极置为重痛要的矿影响灾。对随于培跪养细股胞的乳鉴定汁包括箩污染鄙鉴定妇、生洋存指县标及哲细胞革性质端(如酱细胞兄形态督、生堤长特斥性、盯染色猜体数就目及病结构骡等)沿。燕润躬(一序)岗污染赏鉴定狐缩嘱细胞席培养丑中常绳见的逐污染慨有真匙菌、高细菌棍和支箱原体慌等，绕此外脊有化壶学物洗和非俩同一客种细馅胞的闪污染句。受离到污千染的企细胞山培养忽可明君显地久改变绝生长于特性即，引敌起p紫H变款化和戒生长氧迟缓朗。污抗染常超常表瓜现为铸pH稻变化候，培毯养液击表面顾起泡吓或起贝膜，勺培养拦液中哑的絮辽状物腿及细齐胞生伟长表年面的栽斑点尿，摇疗动培剃养器接皿可旅消失请。肉秃眼见殊不到不的污细染可悬影响陵细胞哥的代幕谢。洒桐匙1.盲鉴谊定方荣法忠真雪菌或种细菌摧的污蹈染可伏用肉判眼或寇低倍帖光学症显微扩镜观牙察，童支原誉体仅讯能用译特别胶的荧织光染汗料如侄Ho管ec叙hs茅t津33苏25达8染慨色后浪在光懒学显巧微镜呜下，锁或用滔扫描耻电子插显微元镜观馅察。巷由于笨用肉眼眼无梅法发氏现支测原体聪的污脂染，悬在细肌胞培墓养过败程中饺应经烛常定瞒期检约查，盐例如比每三臣个月斜。最声简便岩和最堂可靠楼的检辨测支喂原体粮的方根法是窑用荧竟光染霸料染绸色在显显微等镜下这观察肿。狱信扑2.钞处渗理狭基角本的变良好押消毒回技术嫌并不码一定糕能防荣止污币染，鞠还应刻注意静下列扁方面玉：消耐毒步舟骤(疾如高术压锅粱和干堤热消海毒柜隔)的避效果花；多指层流仆防护泡罩的鸭消毒乖效果翅；经烛常检奉查培影养器激皿；饶每个袍工作裁者有姥自己减配制倒的培烧养用锡液，糖处理乏受污伟染的愁培养枕用具松和环局境。罩对于仙已污符染或蜓怀疑晨污染秒的培惑养用允具均仔可用睁2.疲5％箭高氯胳酸处枝理。元用抗切生素架对预掌防或稠去除闸细菌搭污染乏较为够有效厨。对常支原哄体污团染，饿消除爪方法担较多屿，如堵抗生侍素、苏加温匙及动积物体捷内接雹种等悼，但碎都较聚为繁终琐，街且效闲果不疯甚满顶意，托最好太的办秘法是白弃去星，再日重新马培养略。刊膊垮(二译)鼻生存雪指标宝王光1.都台翅盼蓝嫌排斥评试验而打是判俱定细慕胞损误伤的诸快速聚试验分，它毒还可巷很方戏便进圆行细蔑胞计宾数。笛具体罪方法芹如下存：爱①主取少劫量细缠胞混裳悬液竖，加点人等邮量的夸0.琴5％流台盼死蓝溶下液。楚②叮放置柴1-震5m单in捆后，辆将混右合液释滴入论血细梨胞计更数池围内。裕③押显微本镜下惯，细郊胞显设蓝色队的为躲死亡挂细胞迹，尤职其是疾核深添染，括而未壶染的安细胞青为存毒活细蔬胞。葛统计涌出细迟胞总墓数后只，可绒计算哑出细夫胞存吓活率伙。殊户柏2.恼酶门漏出锈的检卡测阔胞叫浆酶迎如乳弦酸脱统氢酶缝(L青DH悦)的过漏出圾检测键也与胆染料谎排斥绿试验栋有同哥样的幸灵敏呈度，师同时软，可按更精挪确地势进行史定量角，但排操作巴时间并较长晕。忙里部(1驾)哭仪器迟：分出光光言度计神，最怀好配补有温颤育(针37写℃仇)的谎装置腾。刑回零(2谱)铲试剂导：纽汽岸溶液木凯0.页9％输Na欺Cl耍，0露.1睡％T槐ri洒to雷rX雀-1朴00室和0佳.1倡％牛否血清短白蛋登白。际衡漂底物坟谜3.滑5g济K湖2确HP谢O挨4挨，0拦.4泼5g葡kH旁2盈PO盖4博和3助1.损0m衬g丙渗酮酸蜘钠溶侨于4弓50译ml访的蒸高馏水粒。配鸽好后边，可渔贮存厕于猴-2耕0终℃放的冰哈箱内餐。棉裂遍NA添DH级，称古42铲mg凳，溶状于4挎.5婚ml携的1界％N狂aH凯CO协3夹，临房用前执配制典。诱思床(3狭)定操作贞步骤摄：离鞋心，贷以适善当速食度使胡所有啊细胞顿沉淀之而不称引起绘细胞刘损伤私。例错如肝瞎细胞画用愈50讽g吸×欣2m广in胳。取牵出上动清，谦放人素干净死试管储，并省保持瘦0逃℃疗以下陕备用晕，加虎入等寺量的坝溶液发至细喜胞沉霜淀，竹用漩但涡混厚合器涌混合帽。保醋持在锡0洲℃全以下飞，备性用。单赢怠取一由比色答杯，案加3防ml筋底物佩，5订0通μ以l的他NA利DH笨和2百5~弱20结0肢μ紫l的企样品遇(取金决于棉培养倦细胞啊的种膊类)借，迅蛮速混轮合后充，在隶34遣0n术m处蜜进行咱比色钳。整辉个过泳程应聚在病37稼℃龄条件葛下完奖成。射计算己上清孔或沉堆淀(走即溶暗液中磁细胞腿)的袋LD邮H活奔性，削漏出血率表照示方报法为壶培养愤液中散LD足H活渣性占论总的堆LD训H活青性的盲百分斩率。律研射3.榆其烘它方佩法险铬租的释盘放，天利用收51符Cr抖3+只可被僵活细艘胞吸夸收，肾并还天原成张51悔Cr骡3+孔，留描在胞耳内，烦而死淘亡细团胞则艇释放榜51橡Cr镰3+京。用备r-花计数恢器检雁测无役细胞衬上清丸液中醒51场Cr淡3+集的量雕，即培可判越断培显养细动胞的骗存活首情况粥。还辉有贴布壁效底率和馆AT干P含波量等过指标正可鉴朋定培送养细望胞的临存活寒情况壮。融尤造(三廉)遗细胞球特性大鉴定等帜价在连连续培词养期纠间，易细胞爬可能惩发生房某些艘变化大，如亏细胞渴与原呢始细毁胞的跌差异痒逐渐桂加大肢。但锣每一吓细胞愿株具身有一滤系列传细胞头特性国“糠正常旗”美的参柳数，志可供射鉴定浴评价项。例桌如，引形态你学参于数、季生长殊特性戒及染访色体膊分析量等皆绣为细爷胞特尖性鉴捡定的腔指标臣，其击中形糟态学恳与生轻长特幅性的隆测定译相对绕容易幼进行脱。胸榆左1.法形丧态学龟检查浙继评价代细胞沃正常舰与否凳的最典简单躺方法那是形司态学此检查乌；应俊在每注次传软代时闹用倒挠置显败微镜置进行馅观察符，最绞好拍豆照记窄录细旦胞的雁形态器。要搁详细保地描奴述每诱一细妹胞系镰的形弟态。草若因糖限于堤篇幅袭，不侄能详被述，屠可掌光握两即个述议语，虽即提“都成纤迟维样璃”芝和镜“俱上皮湖样范”盈细胞兰，即害可描蓝述所瞧观察籍的细牺胞。孕成纤礼维样秋细胞孝系指倍在单街层细旧胞培唯养时但，细炼胞的诚长度戴要大圈于其刊宽度条的两扇倍的粮细胞亲，而巧上皮逼样细校胞系像指呈圆多角贿形的塔细胞月。塑健启2.衔生用长特撕性的浆检查刑废在培卸养细氧胞时乏，其假生长区特性笑的检伟查较直易进洲行，柏主要励通过抵测定岩更换敏培养史液的扰时间搜和传壶代的究时间显来完忽成。垫虽然摧不同勇的细埋胞其辉传代伪时间屯和更怜换培派养液遭的时玻间不沙同，蜜但对植于每化一细狸胞系牧应该体较为川固定厦，因五为主限要取章决于睬细胞集生长著速率棕。拦列肚眯南每个咱细胞副系均约有其灵自己寒的生键长循巴环周烂期，民这取纠决于掩接种范进行开培养和的细嫂胞数莲目。吊一般坊认为阶，在争培养浇中的涛细胞锤，是鸽处于宜不同烦的生瓦长阶斧段。挡进行馋生长冻分析签，应皮观察懂单个企细胞膀的生愿长速月率。孔在实镇际工离作中艺，是施测定链克隆夜效率在或者布接种话效率凉。克匆隆效峡率是春测定伟由单傍个细弦胞生涝长的颂克隆扬。接顷种效源率是遍测定爽植入娇小量饿细胞蜻(2业~5耍0个印／c雁m缸2难)后逢，等烫生长具至可警分辨踢的小张克隆勉时，骗经用琴生理说盐水照洗涤叮，甲嚷醇固树定，奸吉姆僵沙染恭色(未2m蝴l／诞25柴cm描2符)和玩清水恋冲洗燃后，鲁计算青克隆围数。涂接种悄效率优=竖占合一般并认为疫，传母代效锐率小回于3拘0表境示生笨长不伐正常纤。此葵项指播标可遗用于叮正常卧细胞溪生长慌的监续测，耐贮存香细胞睛的复蝇苏及剥鉴定笛每一孟批血肢清等何。掉债概在细废胞培土养试扣验中殊，一午般监来测指访标可凡采用债形态柴学、避生长配模式舞及接钩种效幻率即鼻可。扁玉蒸3.误其振它检罚查盏除流上述偷指标链外，尤在细猪胞培跨养时昨，可熟进行设染色血体分叔析，筝包括适染色学体的治数目斯和结湿构以蹲及D宗NA常、R着NA岂和蛋党白质债的含豆量测旗定，断来判熊断培霸养细正胞的蝇特性胆。洲七、故细胞幕培养飞在食辨品毒梁理学涂中应关用蜂稍寿利用驰培养酬的细皆胞，止可进鄙行多隐方面乓的毒碰理学扫研究甚，如鞠表1芬2-泛4中晒所列倍。季表1功2-惰4杆培碰养细崇胞用颠于毒按理学疏体外抓实验杂的实段例倾挺巡廊一般挨毒性断：主再要为告急性演细胞狱毒性茄同遗器官沙特异扮性毒幼性：奖利用青有代则表性揉细胞担类型冶如肝岭细胞邪、肾企近曲宣小管挪细胞担、神业经细匹胞及穗心肌确细胞泽等：造炼帝恨毒作敌用机逼理戴悦经眠生物猜转化怀、毒早性代杏谢产耐物的灭形成虽候芦懂遗传千毒性妈，如类程序昏外D誓NA雄合成掩测定穗债劝陕繁殖磨毒性挪冲舱傍联合传毒性龙颤精东不同版物种跃间的垦比较胜毒性披滑茂秒光敏或毒性偶院改以下首重点肌讨论升毒理乐学中再应用缝细胞究培养赶技术啊时应校注意删的几煎个问妖题。纺倘歼1.缩细凳胞类氧型的燥选择山笑细胞娘类型夏的选拐择取释决于置实验主的目叨的。宴一般最性筛勺选系洁列化漂合物辩的一裁般毒轻性时斑，应见选择冻生长恐迅速离且易贡于处遣理的埋细胞长系。袄机理作研究排多不沈用细花胞系甩，因骨为培迈养的溪细胞难会逐意渐丧亡失许近多功巷能，卫如细级胞色盯素P旨-4洋50响的活智性。葵捉街泡迈细胞显培养峡的优匙点之列一是鸟可选绪择来雀源于谁人体先的组苍织细惩胞，斥可减被少试样验结留果的晓物种欢差异燃。成偶纤维衔样细所胞和恶上皮观样细班胞均尿可选趴用。缺常用篇的细检胞系老有C祖HO俘、V性79盖、H爹el晕a、踪BH悟R及墙L9揭29豆等。对许政2.甚代洗谢活驰化速细理胞经递8-歉24源h培玩养后坚，细训胞色敏素P禁-4仿50迫活性登将迅伯速下犬降。潮而在拔CH堵O细拖胞系右中，片涉及潜代谢易活化南的酶膜活性丹下降怨。所敲以，牛培养水细胞征对需旅代谢有活化舍的化反学物愿不能险够敏介感。度告母解决于这个霸问题退有两享个方铜法，鸭一是馅加S晌9，溪二是折与原总代肝监细胞夺复合谁培养路。S庆9需结要N糠AD介PH江才具睬有代锻谢活潮化作葛用，陵故在黑培养厦液中正应加远有N颈AD报PH旨生成娘系统妈(葡将萄糖骂-6寿-磷成酸脱可氢酶牢、葡摸萄糖耳-6还-磷鉴酸和恰NA滑DP所)。绣与原铸代肝镰细胞岂进行奸复合菌培养膊时也坦可采哀用其品它不逮同的浊细胞棵系，腿如V桐79脖、中划国地禾鼠肺扒成纤终维细奖胞和欧人成捷纤维伞细胞唯。守盗妈慢泽3.龙受纺试物旁的给失予许参多瓣受猪试物房由于搁水溶门性较巧低，辨在加喇入培倚养液典前，腔常需建溶于元有机零溶剂厌有机暮溶剂作对细龟胞有蹲损害洲作用误，故田应限膊制有筹机溶沾剂浓蚕度在留1％若以下登。在收试验命中可求设立险适当东的有灭机溶鹿剂对扮照和准培养匀液对涂照。谋例如雀，需搜用S都9混略合液研；有要机溶温剂的肠浓度伯应限免制在营0.遣1％资，因须为许节多有耍机溶衰剂可泻抑制未酶的您活性廊。不促溶性周的受膏试物浊如，锯颗粒哪和油堂剂在炒给予色培养浇液时膝仍存睬在问庄题。文一般网是混店悬于疤培养傅液或脑者先贤溶于未溶剂轰，再索加人武培养趁液，帮但有结时会葛产生轨不同变的毒兆性结子果。迷例如敲，黄谎樟醚赚和降额脂乙芳醚等床油性仔受试汤物，杯假如铁使用墓高剂乞量时羞将有占某些击塑料絮培养啊皿成尤分的耻溶出申，则邮所观袖察到针的毒奉性作滨用可绪能部份分地换是由遥于某望些塑椒料成狐分所餐致。博牛晕4.挑设味立阳肃性对事照组桨翅实验呼系统科的重沈现性村应该踢用阳迫性对殖照物耳来检边查。府阳性李对照河物指绳采用凉经过膜研究甜或公干认有图特定权作用课的化论学物追。例污如在墨代谢齿活化挪研究母中常四选择妇环磷皆酰胺恋为阳险性对顽照物叔，在凤细胞莫毒性元筛检泥时可西选二勾甲基巡环己唤基烃际乙基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