分子生物学实验指导(2023版)

供生物科学、生物技术专业用

分子生物学实验指导

1.分子生物学实验须知

1.1.基本要求

1.进入实验室的学生须严格遵守实验室规则。

2.课前复习有关课堂讲授的理论知识，并根据实验指导认真预习实验。

3.明确实验目的，掌握实验设计的原理。做到心中有数，有备而来。

4.认真对待每一次实验，按照要求和拟定好的流程进行操作，详细、真

实地记录实验中每一个细小变化。

5.实验结束后须按照要求完成实验报告，实验报告书写工整、内容翔

实、表述清晰、分析有据。

除此之外，鼓励学生积极参与实验准备；保持活跃的思维，积极与教师交

流实验体会。

1.2.实验室规则

1.保持肃静不得喧哗、嬉闹，使用器物时轻拿轻放，讨论问题时不得影

响他人。

2.保持整洁上实验课时应穿工作服，书包等物品应在规定位置摆放整

齐，尽量避免被试剂等实验用品玷污。实验结束后，按具体要求清洗实验用

品，所用的试剂和器材整理后放回原处，实验废品放人指定地方。

3.严格操作做实验时严格遵守操作规程，仔细观察，如实记录。玻璃器

皿轻拿轻放，移液器吸头、滴管专用专放，防止交叉污染。使用精密仪器必须

在教师的指导下进行，不得随意动用。使用微量移液器前，必须熟悉微量移液

器的使用方法。

4.注意节约爱惜样品、器材，节约试剂、水电，防止器物的破损。使用

不当所造成的损坏须酌情赔偿。

5.保证安全室内严禁吸烟。使用有毒试剂、腐蚀性试剂等危险物品时要

严格按要求操作，注意防护、防止污染。如有意外立即报告。实验完毕后，清

洁室内卫生，关好门、窗、水、电等。

1.3.实验室常识

1.称量固体试剂，应用硫酸纸，不可用滤纸。量筒是量器，不可用做容

器。

2.取用试剂和溶液后，应立即将瓶塞塞严，放回原处。取出的试剂和标

准溶液，如未用尽，切勿倒回瓶内，以免污染。

3.使用有挥发性或毒性的试剂和进行会产生有异味气体的实验操作时，

均应在通风柜内。试剂用后严密封口，尽量缩短操作时间、减少外泄。操作者

最好戴口罩、手套进行操作。

4.配制完成的试剂须及时做好标记，标签上要写明试剂的名称、规格、

浓度、配制日期及配制

人等必要信息，标签应贴在试剂瓶上1/3处。5.使用离心机前必须配

平样品，离心时若有异常的噪音应立即停止机器，关闭电源后方可仔细查找原

因，排除故障前不得继续使用离心机。低温离心结束后，离心机应敞开晾至室

温并清理凝结水后方可关闭。操作中如有样品不慎洒入离心机的管槽或底盘，

必须及时清理后才能继续使用。6.应在带习老师指导下使用贵重或精密仪

器，并要严格遵守操作规程，如遇试剂溅污仪器，及时用洁净纱布擦拭。发生

故障时，应立即关机，告知带习老师，不得擅自拆修。

7.实验用过的器皿应及时用消毒液或自来水浸泡，以便于清洗和减少试

剂对器皿的侵蚀。洗净的器皿应倒置架上自然干燥，不能用抹布擦拭。

1.4.实验室安全防护

1.最后离开实验室时，一定要将室内检查一遍，应将水、电等关好，门

窗锁好。

2.使用电器设备时，如烤箱、恒温水浴锅、离心机、电泳仪等，严防触

电，绝不可用湿手开关电闸和电器开关。

3.使用高压锅消毒时，人不得离开。易燃、易爆、腐蚀、有毒等试剂，

不能放入高压锅内消毒，以防发生爆炸，造成人身伤亡。

4.使用可燃物，特别是易燃物时，如乙酸、丙酮、乙醇等，应特别小

心。

5.凡使用腐蚀性试剂如浓酸、浓碱等，必须极为小心地操作，防止溅

出，一旦有洒出，立即用自来水冲洗。

6.废液应按要求妥善处理。

2.实验常用仪器介绍

2.1.微量移液器

微量移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精密取液装置，基本原

理是依靠装置内活塞的上下移动，推动按钮带动推动杆使活塞向下移动，排除

活塞腔内的气体；松手后，活塞在复位弹簧的作用下恢复原位，从而完成一次

吸液过程。常用的有Eppendorf公司各种规格的的微量移液器，其他还有美

国TOMOS公司、德国BRAND公司等产品。目前使用的移液器有整支可消

毒移液器、半支可消毒移液器、电动移液器、PCR专用移液器。此外还有大容

量移液器、电子连续移液器、瓶口移液器、电子滴定器等不同种类的移液器。

微量移液器的标准操作适用的液体有水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶

液，其操作步骤第一步按到第一档，垂直进入液面几毫米，第二步缓慢松开控

制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少，

第三步打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿几秒后，待剩

余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。

在使用移液器的过程中，应注意以下几个方面：

1）移液器应放在专用的架子上，不得随意放置；

2）移液时选用适当型号的移液器，不得用大量程的移液器移取小体积样

品;

3）吸不同的液体时应更换吸头，防止交叉污染影响实验结果；

4）新吸头在使用前可吸排溶液几次，浸渍吸头以消除测量误差；

5）移液器吸液后严禁倒置、平放，以免液体倒流损坏活塞；

6）长时间不用或刚取出的新移液器应轻轻按压按钮数次，再进行正常使

用。

2.2.离心机

离心机是实验中最常用的一类仪器，主要用于细胞的收集和分离、基因片

段的分离以及其它生物样品的分离制备。离心机依据转速不同，可分为低速离

心机、高速离心机和超速离心机，转速少于6000r/min的为低速离心机，低于

25000r/min的为高速离心机，大于30000r/min的是超速离心机；依据温度控

制不同，又可分为冷冻离心机和普通离心机，冷冻离心机带有制冷系统，能够

控制温度最低至-20C,普通离心机不带制冷系统。

离心机在每次接通电源使用前，应仔细检查所用的转头及离心管有无裂

纹，或严重腐蚀现象，如有应立即更换；保持离心机腔体内清洁，防积水，防

有颗粒状杂物；配转头系统时，必须在仪器断电条件下操作；仪器加速或减速

过程中，出现短时振动属正常现象，不必关断电源开关；若出现中途断电，切

勿马上开门，必须等电机停转后方可开门；离心时样品应预先平衡，使用离心

筒离心时离心筒与样品应同时平衡，挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖

的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔。

2.3.电泳装置

电泳技术是实验中不可缺少的重要分析手段。所谓电泳，是指带电粒子在

电场中的运动，不同物质由于所带电荷及分子量的不同，因此在电场中运动速

度不同，根据这一特征，应用电泳法便可以对不同物质进行定性或定量分析，

或将一定混合物进行组份分析或单个组份提取制备，这在临床检验或实验研究

中具有极其重要的意义。

电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持

物，而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋

酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶薄层等，分子生物学领域

中最常用的是琼脂糖凝胶电泳。

电泳装置是实现电泳分析的仪器，一般由电泳仪、电泳槽、检测单元等组

成。它主要用于检测、鉴定各种生物大分子的纯度、含量及描述它们的特征，

还可以用于样品的分离、纯化、回收和浓缩。

电泳仪作为电泳时的外加电源设备，它既能输出稳定的电流，又能输出稳

定的电压，起到在被分离样品两端加外接电场的作用；电泳槽是电泳的主要部

件，是样品分离的场所；电泳仪在通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、

电泳物，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。同时要求

仪器必须有良好接地端，以防漏电；在通电后，不要临时增加或拨除输出导线

插头，以防短路现象发生，使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异

常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。

2.4.生物安全柜

生物安全柜是为操作具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实

验室环境以及实验材料，使其避免暴露于可能产生的感染性气溶胶和溅出物而

设计的。

根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜也可以分为I级、II级和III级

三种类型。I级生物安全柜可保护工作人员和环境而不保护样品。气流原理和

实验室通风橱一样，不同之处在于排气口安装有HEPA过滤器。所有类型的

生物安全柜都在排气和进气口使用HEPA过滤器。H级生物安全柜是目前临

床分子诊断实验室应用最为广泛的柜型，II级生物安全柜的一个独特之处在于

经过HEPA过滤器过滤的垂直层流气流从安全柜顶部吹下，被称作“下沉气

流”，下沉气流不断吹过安全柜工作区域，以保护柜中的试验品不被外界尘埃

或细菌污染。按照《中华人民共和国医药行业标准YY0569-2005生物安全

柜》中的规定，II级生物安全柜依照入口气流风速、排气方式和循环方式可分

为4个级别：A1型，A2型；B1型和B2型。所有的H级生物安全柜都可提

供工作人员、环境和样品的三重保护。III级生物安全柜柜体完全气密，100%

全排放式，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，适用于高风险的病原生

物研究，如进行SARS、埃博拉病毒相关的实验等。

另外，需要了解生物安全柜与通风柜和超净工作台的区别。通风柜和超净

工作台不属于生物安全柜，不可使用在涉及微生物材料的实验或生产过程中。

通风柜（通风橱）是为在化学实验过程中清除腐蚀性化学气体和有毒烟雾而设

计的，不能有效清除微生物介质；放置在通风柜内的微生物样品会散播到柜

外，污染实验室环境。

超净工作台是为了保护试验品或样品而设计的，通过吹过工作区域的空气

防止试验品或样品受到工作区域外粉尘或细菌的污染。一旦微生物样品放置于

工作区域，层流空气将把带有微生物介质的空气吹向前台工作人员而产生危

险。

在实验中，被分类为可能涉及或者产生有害生物物质的操作过程都应该在

生物安全柜内进行，一般使用13级的生物安全柜。

2.5.消毒灭菌设备

实验中所用的培养基、试剂、器皿、实验用具等，应严格灭菌。常用的灭

菌设备主要包括滤膜过滤器和高压蒸汽灭菌器等。

滤膜过滤器的过滤原理主要是分子筛作用，大于膜孔的颗粒被截留（筛除）

在膜的表面，小于膜孔的颗粒通过膜孔。在实验中常用来制备抗生素滤液。

高压蒸汽灭菌器是利用饱和压力蒸汽对物品进行迅速而可靠的消毒，适用

于对医疗器械、敷料、

玻璃器皿、培养基等进行消毒灭菌。在使用过程中应注意：灭菌前应先完

全排除锅内冷空气，使锅内全部充满水蒸汽时，灭菌才能彻底；灭菌后当压力

降到零后，才能开盖；培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止

培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。

2.6.水纯化设备

实验中对实验用水的质量要求非常高，器皿经洗净后都需要双蒸水漂洗数

次，试剂的配制要求用三蒸水甚至超纯水，这就要求实验室必须配备纯水装

置。目前较常用的水纯化装置有石英玻璃双蒸储器、离子交换器以及超纯水系

统等。

超纯水系统是采用预处理、反渗透技术、超纯化处理等方法，将水中的导

电介质几乎完全去除，

又将水中不解离的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水处理设

备。所得水可用于高效液相色谱（HPLC）、原子吸收及发射光谱分析、质谱

分析等。

2.7.PCR仪

简单地说，PCR就是利用耐热DNA聚合酶对特定基因在体外的大量合

成。PCR仪是体外扩增基因最常用的设备，主要由机械自动装置、温度循环系

统及附属设备等构成。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪

分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪等种

类。

普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，荧光定量PCR仪比普通的

PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，其不仅可对核酸进行扩

增，而且可通过TaqMan荧光探针，SYBRGreen荧光染料等方法对扩增后的

样品进行定量测定。且一次可同时检测数百个样品量，样品到达域值水平所经

历的循环数称为Ct值（限制点的循环数），可以用来计算未知样品的浓度。

2.8.紫外观察仪及凝胶成像分析系统

主要用于琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳后结果的观察和记录。

2.8.1.紫外观察仪

DNA片段经电泳后肉眼是观察不到的，经由与漠化乙锭等荧光染料结合，

在紫外灯的照射下会产生荧光，从而可以利用来紫外观察仪来进行定性和半定

量观察。用于核酸分析的紫外观察仪常采用254nm、300nm、365nm等几个波

长，在此波长范围内，DNA与漠化乙锭结合物对紫外光吸收较强，从而诱导

产生590nm波长的橙红色荧光。产生的荧光强度与DNA的数量相关。

2.8.2.凝胶成像分析系统

通过紫外观察仪只能对凝胶电泳图谱进行观察，如果需要记录结果，可以

借助凝胶成像系统拍摄成像。该系统具有强大的图像采集、检测和分析能力，

可以对DNA、RNA、蛋白质等电泳凝胶以及各类杂交，放射自显影结果进行

拍摄、处理、分析和保存。

2.9.其他常用仪器设备

2.9.1.紫外/可见分光光度计

紫外/可见分光光度计广泛应用临床检验等领域的教学和科研工作中，特别

适合对各种液态物质进行定量及定性分析。其应用波长范围为200~400nm的

紫外光区、400~850nm的可见光区。主要由辐射源（光源）、色散系统、检测

系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。临床实验中常

用紫外260nm、280nm检测核酸的含量及纯度。

2.9.2.二氧化碳培养箱

二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞或组织在生

物体内的生长环境，如稳定的温度（37℃）＞稳定的C02水平（5%）、恒定

的酸碱度（pH值：7.2-74）、较高的相对饱和湿度（95%）,来对细胞或组织

进行体外培养的一种装置。其广泛应用于细胞、组织培养和某些特殊微生物的

培养。

2.9.3.分析天平

分析天平是实验中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其

使用方法，是获得可靠实验结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天

平、阻尼分析天平及电子分析天平等，需要根据实验精确度和量程要求的不同

进行选择。在使用天平的过程中，要注意以下几个方面：

1.天平应放置在牢固平稳的水泥或木质台面上，称量室内要求清洁、干

燥及较恒定的温度，同时应避免光线直接照射到天平上；

2.称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平

摆动；

3.电子分析天平若长时间不使用，则应定时通电预热，每周一次，每次

预热2h,以确保仪器始终处于良好使用状态；

4.天平箱内应放置吸潮剂（如硅胶），当吸潮剂吸水变色，应立即高温

烘烤更换，以确保吸湿性能;

5.挥发性、腐蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，防止腐

蚀天平。

2.9.4.恒温水浴箱

实验中，经常需要在某一恒定的温度下进行，有的需要恒温水浴过夜。此

时需要用到恒温水浴箱。使用时先加蒸储水于水箱内，再接通电源，然后调节

至所需温度，禁止干烧。当设置温度值超过水温时，加热指示灯亮，表明加热

器已开始工作；在水温达到所需水温时，恒温指示灯亮，加热指示灯熄灭，此

时加热器停止工作。由于水箱内水是静止的，故水温上下之间有一定差异，需

要经过反复加热转换后，水温才能达到恒定的状态。

3.实验一基因组DNA的分离纯化

核酸作为生命信息的主要载体，是分子生物学重要的分析研究对象。核酸

包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两种分子，在细胞中均与蛋白质结合。真核生物

染色体DNA为双链线性分子；原核生物"染色体"DNA为双链环状分子。从生

物体中提取分离特定种类的核酸分子，通常是分子生物学研究的首要任务和工

作基础。核酸的分离和提取是分子生物学研究中重要的技术，核酸样品质量的

好坏直接关系到实验的成败。

基因组是细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子，包含

了该物种生长、发育、繁殖等各项生理活动的几乎全部信息，对基因组的结

构、组成以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度

高，产率好，且不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染基因组以用于下游分析。

基因组DNA来源不同、性质不同以及用途不同，其分离方法也不尽相

同，本实验以人体外周血细胞和原核生物细菌基因组抽提为例，介绍制备基因

组样品的常用方法。

3.1.第一部分大肠杆菌DNA的分离纯化

3.1.1.实验原理

DNA提取的方法很多，根据实验用途可繁可简。苯酚抽提法为经典方法，

是利用核酸与蛋白质对苯酚和氯仿的变性作用具有的不同反应性分离核酸与蛋

白质。用苯酚抽提和离心以后，样品中的蛋白质成分被变性，或者变成不溶性

物质，而核酸则溶解在水相溶液中。苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿的混合溶

液。这种混合液a.相对减少酚的用量，并最终可除去残留的酚，减轻对DNA

的破坏；b.使蛋白变性更彻底；c.抑制核酸酶的活性；随后用氯仿：异戊醇抽

提，将残留苯酚从含核酸的水相中除去。

3.1.2.实验目的

1.掌握酚-氯仿抽提法的原理。

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2.熟练操作酚抽提法分离DNA的实验步骤。

3.理解主要试剂的作用。

3.1.3.实验材料

1.酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）酚的重蒸储和平衡：

①酚易氧化，其氧化产物对DNA有破坏作用，使用前需要将酚进行重蒸

储。苯酚16513熔化后，用空气冷凝管进行重蒸储，183团收集纯净酚。由

于酚是中强酸，使用前要进行酚的平衡。方法是在纯净酚中加入等体积的

Imol/LTris.Cl缓冲液（PH8.0）并加入固体Tris,激烈震荡使酚的PH值平

衡到8.0,保存到棕色瓶中，并加入8-羟基喳宁；表面覆盖一层

0.1mol/LTris.Cl（PH8.0）防止氧化。

②8-羟基口奎宁的作用：a.抗氧化；b.指示颜色（若黄色的酚变色为红色则表

明产生了酚的氧化物），易于观察分层情况。

2.TES缓冲液（PH8.0）：lOmmol/LTris.ClPH8.0

Immol/LEDTAPH8.0

O.lmmol/LNaCl

3.TES-蔗糖缓冲液（蔗糖：增加溶液粘度，维持渗透压，防止

DNA受机械剪切力作用而降解。）

4.溶菌酶（50mg/ml，低温保存,溶菌酶是糖背水解酶，水解菌体细

胞壁的主要化学成分肽聚糖中的供1,4糖昔键，因而具有溶菌作

用）。

5.10%SDS溶液（当室温低于2013时,需要加热使其完全溶解后使

用）

6.氯仿/异戊醇（24/1,异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽

提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水

相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。）

7.3mol/LNaAC

8.无水乙醇（-20团）及70%乙醇四、操作步骤

1.细菌培养物：取单个大肠杆菌菌落于LB培养基中，37国振荡培养

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过夜。

2.吸取已培养好的大肠杆菌液8.0ml于lOmlEP管中,4000rpm离心

5分钟，弃去上清，加入5ml的TES液，强烈振荡洗菌体1-2次，如上

述方法收集菌体。

3.弃去TES液后，管底菌体大约200位，加入预冷TES-蔗糖液约

1ml,在冰浴中充分混匀，加入溶菌酶（50mg/ml）40m至终浓度

2mg/ml,EDTA（0.25mol/L）溶液0.5ml至终浓度为0.1mol/L,充分混匀

后，放置在冰浴上5分钟，充分抑制DNA酶的活性。

4.加入10%SDS溶液0.2ml,轻轻混匀，于37团裂解30分钟。在

37团裂解后呈现为粘稠状液体。若裂解效果不好，将液体分装到两个

1.5mlEP管中加入20mg/ml的蛋白酶K20uL,7013恒温金属浴上再消化

10分钟。

注意！SDS在室温小于2013时会出现白色沉淀，使用前需要3713水浴预

热。

5.将试管内的裂解液分装在两个L5mlEP管中，约0.6ml。取其中

一管进行下一步试验，加入等体积（0.6ml）的酚/氯仿/异戊醇

（25/24/1）进行抽提。具体操作是：温和颠倒EP管以混匀两相液面，使

酚和水两相在静置时呈不分层的乳白色混悬液。然后于12000rpm,离心5

分钟。注意！①由于酚/氯仿有腐蚀性，务必戴手套操作此步骤；②使用

专用的刻度吸管而不要用微量移液器加样。

6.小心取出EP管，将上层水相（含DNA）转移入另一个1.5mlEP

管中（小心不要吸出水相下的蛋白质沉淀），加入等体积的氯仿：异戊醇

（24：1）,抽提一次，操作同前。抽提后于

12000rpm,离心5分钟。（这一步可视具体情况而做取舍）

7.吸取水相于另一EP管中，加入1/10倍体积的NaAC,和2.5倍

体积的冰乙醇（无水乙醇

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-20因冷冻储存），颠倒混匀（观察DNA絮状物沉淀）。

8.12000rpm,离心2分钟，弃去乙醇，加入70%的乙醇轻轻振荡洗

涤DNA沉淀，12000rpm,

离心2分钟。弃去70%的乙醇。

9.室温开盖或真空冻干挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥，

视DNA提取量加入20-40|jl

TE于DNA沉淀中，溶解DNA,DNA完全溶解通常需12-24小时，-2013保

存。

3.2.第二部分真核细胞基因组DNA的分离纯化（离心柱层析

法）

3.2.1.实验原理

真核生物基因组DNA的分离纯化在技术路线设计上与原核生物

DNA分离纯化没有本质区别，但真核生物基因组更庞大，细胞核内染色

体DNA占总DNA的95%以上，这些染色体由组蛋白和双链DNA形

成的核小体组成。所以提取真核生物基因组DNA就必须增加解聚核小体

这一步。

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本次实验使用了临床更常见的离心柱层析法去分QIAampDNAMicroProcedure

离DNA,其设计思路和原理是①收集抗凝全血

后利用红细胞裂解液高效降解红细胞，离心后收

集有核细胞。②使用含SDS的结合液裂解有核

细胞的同时使用蛋白酶K解聚核小体，③基

因组DNA在高盐离子浓度下选择性吸附在离心

BindDNA

柱内硅基质膜上④使用抑制物去除液和70%乙

醇（漂洗液）将蛋白、细胞代谢物等杂质去除。

⑤最后低盐洗脱液将纯净的基因Wash

DNA从硅基质膜洗脱。

3.2.2.实验材料

1.结合液CB（细胞裂解缓冲液）：

lOmmol/ETris.Cl（PH8.0）0.1mmol/LEDTA

20jig/mlRNA酶0.5-1.0%SDSReady-to-useDNA

2.蛋白酶K20mg/ml

3.离心吸附柱

4.抑制物去除液IR

5.漂洗液（70%乙醇）

6.洗脱缓冲液EB

7.异丙醇

3.2.3.操作步骤

结合液CB

►加入异丙醉।＞吸附柱吸附

雷白施K处理

洗脱液洗脱漂洗液漂洗抑制物去除

4.抗凝血使用前温和颠倒混匀3~5次，取200口L抗凝全血加入EP管

中。

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5.加入20UL蛋白酶K,充分混匀，加入200UL结合液CB立刻充分

混匀（涡旋混匀器或是加样枪吹打）10秒。

6.70团金属浴5分钟。如果室温放置，DNA产量将降低10~20%。

7.冰浴1分钟冷却后，加入100UL异丙醇，涡旋混匀器充分混均10

秒，此时溶液可能出现沉淀。一定要确保离心管底的液体被震荡起来。

8.小心将上一步混合液转移吸附柱AC（吸附柱外套一个收集管）中，避

免触及中间的白膜。

室温放置2分钟，12000rpm室温离心2分钟，弃穿透液（收集管中

的废液）。

9.加500HL抑制物去除液IR到吸附柱中，12000rpm室温离心1分

钟，弃穿透液。

10.加500HL漂洗液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心1分钟，弃穿

透液。

11.加500UL漂洗液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心1分钟，弃穿

透液。

12.将吸附柱放回到空收集管中，不加任何试剂12000rpm室温再离心2

分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会污染DNAo

13.室温放置半分钟使残留乙醇挥发。

14.将离心吸附柱转移到一新的1.5mL塑料离心管中（做好标记），加入

50ULDNA洗脱液（预热到70国），室温放置离心吸附柱1-2分钟。

12000rpm室温离心1分钟，离心管中溶液即为DNA样品，可以立即

使用或存放于-2013冰箱待用。

3.3.注意事项

1.为保证核酸的完整性和纯度，实验中尽量简化操作步骤，缩短过

程，以减少有害因素破坏。

2.减少化学因素对核酸的降解：过酸和过碱的环境都可引起DNA的

一级结构的破坏，所以实验中的缓冲液要求使用PH8.0的Tris.Cl缓冲

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液。

3.减少物理因素对核酸的破坏：分离过程中的离心、吸取、转移等，

产生的机械剪切力和高温都对DNA的一级结构有破坏作用。所以实验中的

振荡混匀动作要温和轻柔，要求低温的操作要在冰浴上进行。

4.减少生物因素对核酸的破坏：防止核酸的生物降解主要针对DNA

酶对DNA有降解作用，在实验中要使用DTA来抑制DNA酶的活性。

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4.实验二碱裂解法制备质粒DNA

4.1.实验原理

从细菌中制备质粒DNA的方法众多，目前常用的有碱裂解法等。碱裂解

法抽提效果良好，既经济且得率又较高，制备的质粒DNA可以用于酶切、连

接与转化。

碱裂解法的原理：基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而

达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，

双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭

合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其

pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色

体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳

定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

4.2.实验目的

1.掌握碱裂解法的原理。

2.熟练操作碱裂解法制备质粒DNA的实验步骤。

3.理解主要试剂的作用。

4.3.实验材料

1.转化好的质粒菌株(细菌菌液)

2.STE：O.lmol/LNaCl

lOmmol/LTris.Cl(pH8.O)

1mmol/LEDTA

3.溶液国：50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA

4.溶液回：0.2mol/LNaOH

1%SDS

加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒

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DNA的变性。SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋

白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成

为复合物，使蛋白质变性沉淀下来。

5.溶液团：5mol/LKAC60ml

冰醋酸15ml

水28.5ml

pH4.8的KAc溶液是为了把pH12.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒

DNA能够复性，并能稳定存在。高盐3moi/LKAc有利于变性的大分子染色

体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和

了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作

用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。

6.酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）

7.乙醇

8.TE（PH8.0）（含无DNA酶的RNA酶20ng/ml）

4.3.1.方案一碱裂解联合酚抽提法

4.4.操作步骤

1.增殖细菌，扩增质粒

将保存的质粒菌株挑取一环，接种于含相应抗生素的LB固体培养基平

板上。37国培养过液（约

16h）；挑取琼脂培养板上的单菌落，移至200mlLB培养液中（含相应的抗

生素）强烈摇荡过夜约

16小时。

此步骤已由实验准备老师完成。

2.取1.4ml培养液移至EP管中，12000rpm,离心1分钟，弃上清。

3.加入1mlSTE溶液强烈振荡悬浮菌体沉淀，以漂洗菌体，在

12000rpm,离心1分钟回收菌体。

离心后，去尽上清液。可重复1-2次。

4.将细菌沉淀悬浮于lOOul冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀5-10秒。

5.加入200m溶液团，盖严管盖颠倒EP离心管5次以混合内容物，不要

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强烈振荡，放置冰上5分钟左右。

6.加入150ul溶液回，可以将管盖朝下温和振荡10秒钟，冰水放置3-5

分钟。

7.12000转，4团下离心5分钟，取上清移至1个新EP管中。

8.加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）振荡混匀，12000转，4团下离

心2分钟，取上清移至另一管中。

9.加入2倍体积乙醇（室温），振荡混匀。室温下放置2分钟。

10.12000rpm4EI离心5分钟，弃上清。

11.加入1ml70%乙醇振荡漂洗沉淀，12000rpm,4国离心2分钟，弃上

清，用消毒的滤纸小条

小心吸净管壁上的乙醇，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇几分钟。

12.加入20-50glTE（pH8.0）（含无DNA酶的RNA酶20pig/ml）,溶解

DNA,通过电泳鉴定后，一20团储存。

4.5.注意事项

1.整个实验中变性与复性的时间应控制好，注意冰上操作。

2.加入溶液I时可用力振荡，而加入溶液13以后则只能够轻轻混匀。

3.当加入溶液团5分钟以后，若溶液不变粘稠（用移液嘴沾吸没有丝状物出

现）则终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确等后重做。

4.乙醇沉淀质粒DNA时宜在室温下进行，并应充分混匀。

4.5.1.方案二碱裂解离心柱法

特点：菌体先经碱裂解法处理，再通过离心吸附柱，专一结合DNA,最

后洗去杂质，高效快速提取质粒DNA,全套操作可以在30分钟之内完成。

使用试剂盒可从1-5mL过夜培养的菌液纯化得到高达20Hg的高纯度质

粒DNA（OD260/OD280=1.8-2.0）,可以直接用于酶切、转化、测序及PCR

等。

1,快速、步骤少，整个操作在半个小时之内完成。

2.不需要预平衡离心吸附柱。

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3.纯度高，采用本试剂盒提取的质粒0D比值在1.8-2.0之间。

4.产量高，每毫升过夜培养的细菌可以提取到2-5ug/mLo

4.6.操作方法

1.先将全部RNaseA溶液全部加入到溶液A中，摇匀后再取用，未用完的

溶液A最好在4团保存。

2.从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37团震荡培养12-16小

时（摇床转速200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培

养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统处理能力而降低DNA质量。另

外，延长培养时间有利于提高质粒DNA浓度，但是菌液培养过长时间会

因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。

3.用1.5mL离心管收集1-4mL过夜培养饱和菌液，室温12,000rpm离心

1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。

4.加入250"L溶液A,用枪头充分吹打使菌体重悬（此步在冰上操作效果

更佳）。注意：细胞未充分悬浮会影响后续操作，可以使用漩涡振荡器帮

助混匀或使用吸头吹打沉淀至完全混匀。

5.加入250UL溶液B（如果溶液B有沉淀，用前须37团加热溶解后冷却

到室温方可使用），温和反复颠倒混匀4-6次，看到溶液变粘即可，然后

冰上放置不超过4-5分钟。注意：此步处理不能超过5分钟，否则DNA

的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生

的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空

气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH,降低

其效率）。

6.加入350UL冰上预冷的溶液C,反复颠倒混匀4-6次，可见白色沉淀

物产生，然后冰上放置至少5分钟。

7.12000rpm离心5分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的

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溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉

淀即可。静置2分钟以让质粒DNA与吸附柱充分结合，此步十分重要。

8.室温12,000rpm离心1分钟，弃收集管中的废液。

9.加入500PL的通用洗柱液，室温12,000rpm离心1分钟，弃收集管中

废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会

挥发。

10.重复上步1次。

11.室温12,000rpm离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留

乙醇会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。

12.将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管（自备）中，加入30-100

UL65-8013预热的DNA

洗脱液2.0,室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液2.0也可以用于洗脱，

但产量稍微有所降低。

13.室温12,000rpm离心1分钟，离心管底溶液即质粒DNA。

4.7.实验三琼脂糖凝胶电泳分离DNA

一、实验原理

与蛋白质分子类似，DNA分子也是两性电离分子。在pH8.0〜8.3时，碱

基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移

动。但不同大小和构象的DNA分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，

迁移率区别很小，难以分开。采用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持介质，发

挥其分子筛效应，则可使分子大小和构象不同的DNA分子迁移率出现较大

差异，从而达到分离目的。电泳后经澳化乙锭染色，在紫外光照射下DNA

显橙红色荧光，可直接观察判断结果或照相。

DNA在凝胶中的迁移率与它的分子量的对数成反比，若将未知DNA的迁

移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离相比较，可以计算出未

知DNA片段的大小。

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二、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及操作技术。

三、实验材料

1.TBE电泳缓冲液

5xTBE称取Tris54克、硼酸27.5g,0.05mol/LEDTA（pH8.0）20ml,加水

至1000mlo应用液为

0.5XTBE,即使用前稀释10倍。

2.琼脂糖（agarose,电泳级）

3.澳化乙锭（EB）1Omg/mJ

称1克澳化乙锭溶于100ml水中，在搅拌器上搅拌数小时，待完全溶解

后，分装，并用锡薄纸包裹，避光-20团保存。

15.6x上样缓冲液0.25%澳酚蓝或0.25%二甲苯青40%

（W/V）蔗糖溶液

16.DNA分子量标记物

如选用限制性内切酶肌〃电酶切入DNA后得到的DNA分子量标志物，其

参照片段的大小（basepair,bp）为：23130、9416、6557、4361、2332、

2027、564、125o

17.制备好的DNA样品四、操作步骤

1.量取10ml5xTBE电泳缓冲液加蒸储水至100ml配置成0.5xTBE电

泳缓冲液。根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入0.5XTBE电泳缓冲液，

加热熔化，注意观察，当心煮沸的液体溢出！当凝胶冷却至60回左右时按

0.5gg/ml加入漠化乙锭溶液，充分混匀。

2.先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒入凝胶（凝胶厚度在

5〜10mm左右）。

3.在凝胶完全凝固后（室温放置20〜30分钟），小心移去透明胶带，将

凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（液面超过胶面约2〜3mm）。再小心取

出梳子。

4.取已制备好的DNA样品lOgl,加入1/5倍体积的6x样品缓冲液（即

2可），充分混匀。用移液器将样品10川小心地加入点样孔。在另一点样孔

中，加入DNA分子量标记物5pile

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5.盖上电泳槽，打开电源并调节电压，电压梯度为10V/cm（通常用100

伏）。电泳40-60分钟，直到澳酚蓝移出2/3的距离（注意：DNA样品从

负极向正极泳动）。

6.将凝胶直接置于透射紫外灯下观察结果，可见到发出桔红色的电泳条

带。如下图

600bp

500bp

400bp

300bp

200bp

lOObp

五、注意事项

1.在水浴中加热溶解琼脂糖时应不断摇动容器，并对光检查溶解的情

况，使附于壁上的颗粒完全溶解。若在微波炉上加热则时间不要过长，以免

引起爆沸，如水分蒸发太多，应适当补充缓冲液。

2.根据加样量选择合适的梳子，梳子插放的深度不宜过深，取出梳子时

应在电泳槽的缓冲液中缓慢的水平向上取出，避免在加样孔中产生气泡。

3.加样孔的加样量依据DNA样品中片段的数量及大小而定。对于

0.5cm宽的加样孔，通常上样量为DNA100~500ngo但上样体积过大，可增

加邻孔之间相互污染的可能性。

4.澳化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性。使用含该染料的溶液时

须戴手套。凡沾染过澳化乙锭的器械或物品，必须经专门处理后，才能进行清

洁或弃去。

5.紫外光对眼睛有害，观察时应戴护目镜或防护面罩。

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4.8.实验四提取真核细胞总RNA

一、实验原理

利用高浓度强变性剂异硫氟酸胭使细胞结构迅速破坏，释放出RNA分

子，通过酚/氯仿抽提即可得到总RNAo

二、实验目的

1.掌握RNA提取的基本方法。

2.学习如何创造一个无RNA酶的环境。

三、实验材料

1.无RNA酶的水的配制在三蒸水中加入0.1%DEPC,37国放置

12-16小时，高压灭菌30分钟，去除残留的DEPCo

2.变性缓冲液4mol/L异硫鼠酸胭25mmol/L柠檬酸钠

0.85%十二烷基肌氨酸钠0.1mol/L。一流基乙醇

3.10%十二烷基肌氨酸钠

4.2mol/LNaAC（pH4.0）

5.水饱和酚液（pH4.0）

6.Trizol试剂：

胭盐：1.盐酸弧；2.异硫氢酸肌;；作用：强烈的蛋白质变性剂；

重蒸酚作用：有机溶剂；蛋白质变性剂；

四、操作步骤方案一异硫鼠酸胭一步法

1.取新鲜组织块（兔肝）500mg,以液氮迅速冷冻或经液氮保存组织，放

入研钵中研磨，边磨边加液氮，直至磨碎。加入变性液5ml混悬，放入匀浆

器中，冰浴下缓慢匀浆至细胞裂解，液体变黏稠。

2.在上述裂解液中，加入1/10倍体积的2moi/LNaAC、等体积的水饱

和酚、1/5体积的氯仿：异戊醇（49：1）（每加一种试剂后均应充分振荡混匀），

置冰浴15分钟，40,12000r/min离心20分钟，小心吸出上清，注意不要

吸出富含蛋白质和DNA的中间界面。

3.加等体积的酚及1/5体积的氯仿:异戊醇（49：1）,颠倒混匀，4团、12

000r/min离心20分钟，小心吸取上清。

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4.加入等体积的异丙醇，一20团沉淀1〜2h。4团、12000r/min离心20

分钟，弃上清，沉淀用

0.3ml变性液，重新混悬至沉淀完全溶解。加等体积异丙醇，混匀，一20回1〜

2h,4团、12000r/min离心20分钟，弃上清，用预冷的75%酒精洗涤沉淀

1〜2次，开盖干燥RNA片刻，加入20p1DEPC

水溶解，-20旧保存。

注意：切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值

会低于1.6o

5.对最后提取的总RNA行1%琼脂糖凝胶电泳检验。如可见28S、18S、

5S三条亮度依次递减的清晰条带，泳道上无明显弥散痕迹，其中28s与18s

条带亮度比值约为2：1,则说明总RNA提取完整无降解，满足后续实验要

求。

4.8.1.28S18S5S

4.8.1.1.方案二Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量

从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA

可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，

Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1.将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研

磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%o

2.研磨液室温放置5分钟，然后以每ImlTrizol液加入0.2ml的比例加入

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氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。冰上静置3min12000rpm,

4团离心15分钟。

3.取上层水相于一新的离心管（取400gl）,按每mlTrizol液加0.5ml异

丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000rpm离心10分钟。（此

步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂）

4.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。，按每mlTrizol液加入至少

1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，室温下8000rpm,室温离心10分

钟。

5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，

否则会降低RNA的

溶解度。然后将RNA沉淀用30glDEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，可

5513-60团水溶10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70团。

五、注意事项

1.操作者应戴手套与口罩，当手套接触了皮肤或不洁的仪器设备后，应及

时更换。

2.提取RNA的所有试剂与玻璃器皿均应用0.1%的DEPC水进行配制与

处理，并在处理完后通

过高压灭菌以除去残留的DEPCo玻璃器皿经高压消毒后并不能有效灭活

RNA酶的活性，还应置

250-300回烘烤4ho

3.最好选用新的一次性塑料用品，使用前高压蒸汽消毒，并于常温下烤干

备用。

4.使用液氮时要特别小心地防护，避免吸人液氮汽，避免直接的冻伤。

5.在总RNA制备过程中，移取含RNA的水相时，为减少界面DNA的

污染，不要吸取靠近界面的下层水相。

问题和处理方法：

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A.样品裂解或匀浆处理不彻底

低得率

B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解

A.检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度

和低pH条件下，A280值会较高。

A26O/A28O<1.B.样品匀浆时加的试剂量太少。

65C.匀浆后样品未在室温放置5分钟。

D.水相中混有有机相。

E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.样品或提取的RNA沉淀保存于-5--20团，未在-60--7013保存。

RNA降解

C.细胞在胰酶处理时被破坏。

D.溶液或离心管未经RNase去除处理。

4.9.实验五核酸的纯度、浓度的测定-紫外分光光度法

一、实验原理

核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，

而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。根据经验数据，纯核酸溶液A260=1.7-

2.0时，认为已达到所要求的纯度。在样品中含有蛋白质等杂质时，会使

A260/A280的比值下降。用此法测定时，只能区别核酸和蛋白质，而无法区别

质粒DNA与染色体DNA及RNAo

计算如下

DNA浓度(|ig/ml)=50pg/mlxA260x

稀释倍数/1000RNA浓度(gg/ml)

=40pig/mlxA260x稀释倍数/1000

二、实验目的掌握核酸的纯度、浓度

测定的原理和方法

三、实验材料待

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测核酸样品、TE

或双蒸水四、操作

步骤

1.吸取50-100^1DNA样品或RNA样品，加双蒸水或TE至3ml混匀

后，转入紫外分光光度计的石英比色杯中。

2.紫外分光光度计先用1ml双蒸水或TE校正零点。

3.在260nm和280nm分别读出光密度值，按上述公式进行计算含量。

五、注意事项

L若为DNA样品，A260/A280比值大于1.8,说明仍存在RNA,可用

RNA酶处理样品；小于

1.6,说明样品中存在蛋白质，应用酚/氯仿抽提一次。

2.若为RNA样品，A260/A280比值小于2.0,也应考虑蛋白质污染，再用酚

/氯仿抽提。

4.10.实验六WNA的限制性内切酶反应

一、实验原理

团型限制性内切酶是能特异性识别双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水

解酶。其识别序列通

常为4-6bp的回文结构，并在识别顺序内进行切割，产生特异的DNA片段，

从而可用于分析和重建

DNAo

本实验用国型酶Hind0（特异识别序列5'-A]AGCTT-3'）对入DNA进

行酶切观察限制性内切酶的特定切割作用。

二、实验目的

1.掌握限制性内切酶的工作原理。

2.理解标准酶解体系的概念、组成。

三、实验材料

LlOxBufferE反应缓冲液：6mmol/LTris.ClpH7.5

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6mmol/LMgCb

lOOmmol/LNaCl

Immol/LDTT

识别序列5'...AjAGCT

2.Hind0(lu/pil)T...3'

3'...TTCGAJA...5'

3ADNA(0.5u

g/p.1)四、操作

步骤

1.建立酶解反应体系(20gl)：

ddH2O14

uL

lOxBufferE反应缓冲液