遗传学实验课程2014-HK配套课件

实验1果蝇遗传性状的观察及饲养 果蝇是在世界各地常见的昆虫,属于昆虫纲,双翅目,果蝇科,果蝇属。果蝇属(Drosophila)有3000多种,我国已发现800多种,遗传学研究中通常用的是黑腹果蝇(D.melanogaster)。作为遗传学研究的材料,果蝇具有非常突出的优点。它形体小,生长迅速,繁殖率高,饲养方便;世代周期短(约12d即可繁殖一代);突变性状多;染色体数目少,基因组小;实验处理十分方便,容易重复实验,便于观察和分析。果蝇的遗传学研究广泛而深入,尤其在基因分离、连锁、互换等方面十分突出,为遗传学的发展作出了突出的贡献。目前果蝇仍然是遗传学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学等研究中常用的模式动物。一、实验目的1.掌握果蝇的基本特征及鉴别雌、雄果蝇的方法,熟悉常见突变型。2.了解果蝇生活周期特征及各阶段的形态变化。3．学会果蝇的饲料制备，为以后实验打下基础。二、实验材料野生型和几种常见的突变型黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。三、仪器设备与药品试剂双筒立体解剖镜,培养瓶(粗平底试管或牛奶瓶)及麻醉瓶(与培养瓶一致的空瓶),白瓷板,毛笔。恒温箱、培养瓶、棉花、纱布、剪刀、麻醉瓶、干燥箱、灭菌锅、白瓷板、铝锅、电炉、玻璃棒、200毫升量筒、1000毫升和250毫升烧杯、酒精灯、镊子、角匙、毛笔、滤纸。丙酸(或乳酸)、乙醚、煤油、75％酒精、琼脂、蔗糖、米粉、麸皮、酵母粉(片)四、实验内容和步骤(一)生活周期的观察果蝇是完全变态昆虫,其完整的生活周期可分为4个明显的时期,即卵、幼虫、蛹和成虫(图1-1)。用放大镜从培养瓶外即可观察到这四个时期,也可取出用立体解剖镜仔细观察。果蝇的生活史果蝇的生活史表1-1生活周期长短与饲养温度的关系温度10℃15℃20℃25℃卵→幼虫8天5天幼虫→成虫57天18天6天4天果蝇的生活周期长短与温度关系很密切,低温使生活周期延长,生活力减低,高于30℃使果蝇不育甚至死亡。果蝇培养的最适温度为20～25℃,25℃培养条件下果蝇从受精卵到成虫约10d,其中卵和幼虫期5d,蛹4d。成虫果蝇在25℃时约成活15d。卵:受精卵白色,椭圆形,腹面稍扁平,长约0.5mm,在前端背面伸出一触丝,它能使卵附着在食物上。幼虫:受精卵经24h就可孵化成幼虫,幼虫经两次蜕皮到第三龄期体长可达4～5mm。肉眼观察可见幼虫一端稍尖为头部,上有一黑色钩状口器。蛹:幼虫4d左右即开始化蛹。化蛹前三龄幼虫停止摄食,爬到相对干燥的表面(如培养瓶壁),渐次形成一个菱形的蛹,起初颜色淡黄、柔软,以后逐渐硬化变成深褐色,此时即将羽化。成虫:刚从蛹壳中羽化出来的果蝇,虫体较肥大,翅还未展开,体表也未完全几丁质化,所以呈半透明的乳白色。透过腹部体壁还可以观察到消化道和性腺。约1h后蝇体即变为粗短椭圆形,双翅伸展,体色加深,如野生型果蝇初为浅灰,后变成灰褐色。成虫果蝇自羽化后8h即可交配。雄果蝇的精子可贮存于雌果蝇的受精囊,以后逐渐释放到输卵管。雌蝇2d后即开始产卵。最初几天每天可产50～70个,随后逐渐减少。(二)果蝇的形态特征和常见的突变类型1.果蝇雌雄性别的鉴别雌雄成蝇在一些形态结构上的区别很明显,可以通过放大镜或直接观察进行鉴别。只有雄性果蝇在腹尖下侧具可识别的外生殖器,但是太微小,难以直接观察辨认。通常在分辨雌雄果蝇时,综合各种形态特征进行观察确定(参见表1-2,图1-2)。表1-2雌雄果蝇的形态特征2.一些常见的突变性状果蝇的突变性状很多,已知的达几百种,并且随着研究的深入会发现或诱变产生更多的突变性状。果蝇的许多突变都是明显而稳定的,而且大多是形态变异,容易观察。图1-3和表1-3列出若干常见的突变性状及其基因符号等,以供参考。表1-3果蝇部分突变性状(三)培养基的配制玉米粉培养基将1.5g琼脂捣碎放入38ml的水中煮溶后，加入10g白糖，制成琼脂糖混合物，再将9g玉米粉和37ml的水加热搅拌成糊状倾入正在煮沸的琼脂糖混合物中，煮沸3-5分钟。待稍降温后加入1ml丙酸，或加入溶于95%乙醇的苯甲酸少许以防腐，搅拌调匀后，将配好的培养基倒入经灭菌的培养瓶中（1-1.5cm厚），倾倒时应注意勿将培养基粘到瓶口或瓶壁上。用灭菌的纱布棉塞塞好瓶口，冷却待用。暂时不用的培养基应放入4℃冰箱中或清洁阴凉处保存。使用前在培养瓶中加入适量干酵母粉或1—2滴酵母菌液。制备前培养瓶、滤纸(用酒精浸湿)、100毫升烧杯干燥灭菌、棉花、纱布高压蒸汽消毒。培养瓶棉塞在饲料制成前做完。高温灭菌，121℃，20min。注：搅拌以免将玉米粉煮糊。煮沸后将烧杯从电炉上取下,稍放置冷却一会儿,将酵母和丙酸加入,用玻璃棒搅拌均匀后分装到5个经高温灭菌的培养瓶内,塞好棉塞备用。注意在分装时不要把培养基倒在瓶壁上。刚配制完的培养基放凉后在瓶壁上会有许多水滴,这时如果把果蝇放进去,水滴可能将果蝇的翅膀粘住,为避免发生此事,可将配好的培养基放在温箱内2～3d,待水分蒸发后再使用,或用酒精棉将瓶壁上的水分擦掉。（四）果蝇麻醉方法 对果蝇进行麻醉处理,是进行性状观察或杂交的必需步骤。麻醉程度是实验成功与否的关键步骤,麻醉不够,果蝇就会飞掉,麻醉过头又会杀死果蝇。用于麻醉的瓶子可用与培养瓶一样的瓶子,麻醉瓶要配上棉塞或软木塞。倒瓶麻醉的操作步骤如下:1.轻摇或轻拍培养瓶使果蝇落于培养瓶底部。2.右手两指取下培养瓶塞,迅速将麻醉瓶口与培养瓶口对接严密。3.左手握紧两瓶接口处,倒转使培养瓶在上。4.紧握两瓶接口,使两瓶稍倾斜,右手轻拍培养瓶将果蝇震落到麻醉瓶中。注意不要将培养瓶中的培养基倒入麻醉瓶。如培养基已变得太稀而易掉落,可采用麻醉瓶在上,而用黑纸或双手遮住培养瓶,使果蝇趋光自动飞入培养瓶中。5.当果蝇进入麻醉瓶后,迅速分开,将两瓶各自盖好。再将麻醉瓶的果蝇拍到瓶底,迅速拔出塞子,在塞子上滴上几滴乙醚,重新塞上麻醉瓶。6.观察麻醉瓶中的果蝇。约半分钟后果蝇便不再爬动。转动瓶子,果蝇在瓶壁上站不稳,麻醉完成,即可倒在白瓷板上进行观察。因麻醉过度被杀死的果蝇翅膀外展,与身体呈45°角。7.果蝇麻醉状态通常可维持5～10min。如果观察中苏醒过来,可进行补救麻醉,即用一平皿,内贴一带乙醚的滤纸条,罩住果蝇形成一临时麻醉小室。六、实验结果1.熟悉野生型和常见突变型果蝇的形态学特征。2.根据实验中介绍的方法,描述自己所观察到的果蝇雌雄个体的形态学特征。七、思考题1.果蝇作为遗传学模式材料的优点有哪些?2.仔细观察果蝇形态,列出雌雄果蝇的各种形态差别。实验二单因子试验(3:1分离试验)一、实验目的通过果蝇单因子杂交试验验证分离规律。二、实验材料及说明 果蝇灰体(++)×黑檀体(ee) 或长翅(++)×痕迹翅(VgVg)三、实验仪器和用品解剖镜、放大镜、米粉培养基用料、培养瓶、麻醉瓶、乙醚、恒温箱、白瓷板(或表玻璃）、毛笔、酒精棉、棉花塞、电炉、铝锅、250毫升烧杯、100毫升烧杯、标签、浆糊、死蝇收集瓶(装煤油)、镊子、200毫升量筒。四、实验步骤(一)确定杂交组合(用正反交比较)(二)选取处女蝇和雄蝇为保证产生的后代均为杂交个体，雌绳必须是处女蝇，可将原种瓶中的果蝇全部倒人死蝇收集瓶内(一个也不留)，在此后8个小时内由蛹羽化的雌绳即是处女蝇。选用处女蝇和雄蝇各3—4对。注：处女蝇的选择过程：用于杂交的亲本雌蝇应该是没有交尾的处女蝇,这样才能保证杂交结果按照实验者所设计的路线进行。那么如何才能得到处女蝇呢?一般来说,刚羽化出来的果蝇在12h之内是不进行交配的,所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见,可以在羽化后的8h内挑选。因此,在杂交实验开始的一段时间内,各实验小组要根据自己的实验设计,精心挑选处女蝇。为了操作方便,可以在每天晚上22:00～23:00将培养瓶内的成蝇杀死,次日早晨8:00～9:00对新羽化出的果蝇进行挑选。可能需要2-3天时间收集。(三)杂交(正反交)用某品种的处女蝇与另一个杂交亲本的雄绳杂交(放入同一个培养瓶)用该品种的雄蝇与另一杂交亲本的处女蝇作反交(放入另一个培养瓶中)，贴上标签，每瓶须保证有5~6对以上。在恒温箱培养。注意：麻醉后的果蝇用毛笔扫人培养瓶时，瓶壁要干燥，培养瓶要横放，待果蝇醒后方可竖起，以免果蝇沾在培养基或湿的瓶壁上造成死亡。麻醉时宜轻度，过重果蝇双翅与身体外展450角表示已死亡。(四)观察果蝇从产卵→孵化→幼虫→蛹的变化，待见第一个蛹出现时(7、8天后)将亲本全部倒出处死。(五)待F1代成虫果蝇出来后(13天后)进行观察并作好记录(接种后20天内为安全期)。(六)选取F1代果蛹5—6对移人另一新配培养基的培养瓶中进行自交。(七)待有蛹出现即倒出F1代果蝇。(八)对F2代果蝇进行观察和统计(F1代接种后20天内为安全期)，凡已观察记录过的果蝇立即处死。(九)整理记录资料作适合性检验并作出统计推断。(十)做好实验小结。五、作业写好实验报告

附：观察记录表（正反交分别记录）试验编号开始日期P表型（基因型）×表型（基因型）↓F1表型（基因型）↓F2表型（基因型）：表型（基因型）理论比例：F1记录表表表型统计日期果蝇数目总计百分数F2记录表表表型统计日期果蝇数目总计百分数

实验三两对因子的自由组合一、试验目的通过果蝇的两因子杂交试验，验证自由组合规律。二、实验材料及说明果蝇黑檀体长翅(ee++)×灰体痕迹翅(++VgVg)要进行正反交三、实验仪器和用品与单因子试验同。四、实验步骤与单因子试验同。 五、作业写好实验报告。附：观察记录表与单因子的类同。

实验四伴性遗传一、实验目的了解果蝇伴性遗传的规律，比较正反交在F1及F2代之间的差异。二、实验材料及说明果蝇雌红眼(x+x+)×雄白眼(xwy)雄白眼(xwxw）×雌红眼(x+y)杂交设计： 按照所设计的杂交组合,如白眼♀×红眼♂选出白眼处女雌蝇2～3只,红眼雄蝇5～7只共同放入一个培养瓶内。在培养瓶上贴好标签,注明杂交内容、日期、实验组号等,然后将培养瓶放入25℃的培养箱内进行培养。如果温度适宜,也可在实验室的窗台上放置培养。当发现培养瓶内有蛹出现后应及时将亲本处死以防发生回交 当有F1个体出现后,观察其表型,注意显、隐性关系并计数统计。在一个新的培养瓶内放入5对F1配成F1×F1,此时不需要选处女蝇。当看到培养瓶内有蛹出现时,将亲本处死。F2果蝇出现后,进行观察统计,观测数目在200只以上。按照所配制的杂交组合,提出理论假设并根据实验结果进行χ2检验。注意:无论是对F1还是对F2进行统计,都要及时进行,避免陆续羽化出的果蝇在培养瓶内交尾后将卵产在培养基内。因此要求实验者不断进行观察,只要有新羽化出的果蝇就要及时取出并进行统计和观察。三、实验仪器和用品与单因子试验同。四、实验步骤附：观察记录与单因子的类同。

实验4-2果蝇唾腺染色体标本的制备和观察1.实验目的 通过实验掌握果蝇唾腺染色体的制片方法,了解果蝇唾腺染色体的形态结构特点并练习解剖果蝇幼虫的技术。2.实验原理 唾腺染色体(salivaryglandchromosome)是一类存在于双翅目昆虫的幼虫唾液腺内的巨大染色体。果蝇的唾腺染色体是典型的巨大染色体,它的巨大性的成因是核内有丝分裂(endomitosis)造成的。由于其染色体DNA经过多次复制(可达210～215次),但并未发生细胞核分裂,同时唾腺细胞中的染色体总是处在配对状态即体细胞联会(somaticsynapsis),重复复制后的染色线聚集在一起,所以在显微镜下看到唾腺染色体要比一般的染色体大得多(可以达到5μm宽,400μm长,是一般中期染色体的100～150倍),又称多线染色体(poletenechromosome)。通过细胞遗传学的研究已经证明多线染色体的带纹与某些特定的基因相联系。由于它的巨大性及其染色体上带纹清晰可数,根据C.B.Bridges等人的研究,至少已经发现5149条可以区别的带纹并已经建立了带纹分布图。因此巨大染色体是遗传学上研究染色体形态结构及染色体畸变的好材料。 黑腹果蝇的染色体数目2n=8,其中第Ⅱ、第Ⅲ染色体为中部着丝粒染色体,第Ⅳ和第Ⅰ(X染色体)染色体为端着丝粒染色体(图9-1)。唾液腺染色体形成时,染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一个染色中心(chromo-center),所以在光学显微镜下可见从染色中心处伸出6条配对的染色体臂,其中5条为长臂,1条为紧靠染色中心的很短的臂。唾液腺染色体经染色后,呈现深浅不同、疏密各异的横纹(band)。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有物种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较分析,而一旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等结构变化,也可较容易地在唾液腺染色体上观察识别出来。3.实验用具及材料 双筒解剖镜、显微镜、解剖针、普通果蝇的三龄幼虫(初学者可使用黑檀体突变体,其幼虫个体较大,易分离得到唾液腺)、生理盐水(NaCl7.5g、KCl0.35g、Ca