实验二球菌的分离培养及微生物学鉴定

试验二球菌的分别培育及微生物学鉴定2-1。形态染色特点革兰染色性形态染色特点革兰染色性形态排列葡萄球菌链球菌肺炎链球菌脑膜炎球菌G＋G＋G＋G－球形球形瓜子仁或矛头状肾形葡萄串状排列链状排列成双排列成双排列血中等大小小菌落凸起小菌落，扁平小菌落、湿大小平外表光滑外表光滑略有凹陷润露滴状，形态板边缘整齐灰白色灰白色灰白色上上甲链：不完全溶血的〔草绿色溶血环〕金葡菌完菌溶血乙链：完全溶血不完全溶血不溶血全溶血落〔透亮溶血环〕特丙链：不溶血点金黄色色素白色柠檬色〔一〕目的要求

1、葡萄球菌属把握葡萄球菌的鉴定方法。生疏葡萄球菌的生物学性状。〔二〕器材和试剂菌种金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌。10g／L盐水琼脂，液体培育基。22试剂双氧水〔H022其他颖兔血浆〔或人血浆、生霉素纸片、标准肠毒素、幼猫、抗肠毒素血清。〔三〕步骤和方法形态观看取一般琼脂平板上葡萄球菌培育物少许与载玻片上生理盐水磨匀，革兰染色后镜检可见革兰阳性葡萄状排列的球菌。菌落观看取三种葡萄球菌分别划线分别接种一般琼脂平板和血琼脂平板，35°C孵育18～24h边缘整齐、不透亮菌落，并可产生不同的脂溶性色素，如金黄色葡萄球菌呈现金黄色色素、上消灭的菌落类似它们在一般琼脂平板上的菌落，但金黄色葡萄球菌菌落四周有明显溶血环，而表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌菌落四周无溶血环。生化反响〔1〕血浆凝固酶试验：①原理：金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附着于细菌外表，在玻片上形成凝块；也可使试管中血浆发生凝固。②方法：球菌菌落少许分别与它们混合，马上观看结果。此法用于测定结合型凝固酶。试管法：取3支10mmX100mm试管，各加0．5mll：4稀释的颖兔血浆〔或人血浆5m5m阳性和阴性菌株肉汤培育物作比照，35°C孵育、每30min观看一次，一般观看3h。此法用于测定游离型凝固酶。③结果和意义：在血浆中呈均匀混浊则为阴性。试管法：细菌使试管内血浆凝固呈胶冻状，为血浆凝固酶试验阳性；反之浆不凝固仍流淌的，则为阴性。血浆凝固酶试验是鉴定致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌的重要试验之一为阳性，后者为阴性。(2)甘露醇发酵试验：①原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培育基由紫色变为黄色。②方法：将三种葡萄球菌分别接种于甘露醇发酵管，35°C孵育18～24h后观看结果。性葡萄球菌可呈阳性，多数非致病性葡萄球菌为阴性。〔3〕触酶试验：①原理：葡萄球菌产生的触酶〔过氧化氢酶〕能将对细菌有害的H2O2，分解成水和氧气。②方法：用接种环挑取葡萄球菌,置于干净载玻片上，滴加3％H2O2溶液1～2滴，1min内观看结果。③结果和意义：产生大量气泡，为触酶试验阳性；而不产生气泡则为阴性〔每次试验应有阳性菌株和阴性菌株作比照。本试验用于鉴别葡萄球菌和链球菌，前者为阳性，后者为阴性(4)耐热核酸酶测定：①原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，它能分解DNA，使含甲苯胺蓝核酸琼脂显示粉红色。②方法：玻片法：取溶化好的甲苯胺蓝核酸琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打6～8个小孔〔孔径2m，各孔分别加1滴经沸水浴3rnin处理过的待检葡萄球菌和阳性、阴性葡萄球菌培育物，35°C孵育弛，观看有无粉红色圈及其大小.60℃枯燥热力灭菌2h，再将溶化的甲苯胺蓝琼脂10ml倾注平板，35°C孵育3h，观看菌落四周有无粉红色圈。酸酶，而不产生耐热核酸酶。〔5〕生霉素敏感试验：原理：表皮葡萄球菌对生霉素敏感，而腐生葡萄球菌则对生霉素耐药。ug/35℃孵育16～20hATCC25923作为阳性比照、以确认纸片是否失效。③结果和意义：抑菌圈直径≤16mm为耐药，＞16mm为敏感。此试验是用于鉴别表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌，前者为阳性，后者阴性。血清学试验〔琼脂集中试验〕〔1〕原理：金黄色葡萄球菌肠毒素与肠毒素抗血清在琼脂板上可形成白色沉淀线(2)方法：将溶化的10g／L盐水琼脂3ml倾注载玻片，在载玻片中心打一小孔，加满肠毒素抗血清，在四周打4个小孔，孔内分别参加标准肠毒素〔阳性比照、液体培育基〔阴性比照35℃２4h孵育后观看结果。〔3〕结果和意义：在中心孔和待检菌孔之间消灭白色沉淀线为阳性，无白色沉淀线为阴性。此试验用于检测金黄色葡萄球菌是否产生肠毒素。动物试验原理：某些致病性葡萄球菌能产生一种耐热性蛋白质、通常在100°C 30min不被破坏，注入动物后可产生食物中毒的病症。方法：将金黄色葡萄球菌48h肉汤培育物煮沸30min〔杀死金黄色葡萄球菌而不破坏肠毒素3000／mi离心1h2m15mi～2h内观看幼猫的状况。结果和意义：幼猫发生呕吐、腹泻、体温上升、畏寒体颤等病症，说明动物肠用于诊断金黄色葡萄球菌引起的人类食物中毒。临床意义染等各种时机感染。〔一〕目的要求

二、链球菌属和肠球菌属１、把握链球菌瞩和肠球茵属生物学特性和鉴定要点。２、把握抗链球菌溶血素“0”试验。〔二〕器材和试剂1 菌种甲、乙、丙型链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌。2 培育基血琼脂平板、马尿酸钠培育基、血清肉汤、菊糖发酵管、七叶苷斜面培育基、65g/LNacl血清肉汤培育基。试剂革兰染色液、Fec13试剂、去氧胆酸钠溶液、抗“0”试剂、美蓝溶液。其他杆菌肽纸片、人血浆、无菌生理盐水、Optochin胞、乳胶反响板、家兔、小白鼠、注射器、剪刀。〔三〕步骤与方法1、形态观看取血琼脂平板上链球菌和肺炎链球菌分别涂片、革兰染色，镜检链球菌为革兰阳性、链状排列的球菌；肺炎链球菌为革兰阳性、成双排列的矛头状球菌。菌落观看链球菌在血琼脂平板上生长后消灭灰白色针尖大小菌落，菌落四周可消灭不同的溶血状况，甲型链球菌菌落四周消灭草绿色溶血环〔α溶血，不完全溶血，乙型链球菌菌落四周消灭透亮溶血环溶血，完全溶血，丙型链球菌菌落四周无溶血环。肺炎链球菌在血琼脂平板上消灭的菌落与甲型链球菌相像灰白色、不透亮的小菌落，菌落四周可消灭а溶血环，也可无溶血环。生化反响〔1〕杆菌肽敏感试验：②方法：挑取被检的链球菌菌落，密集划在血平板上，将杆菌肽纸片〔0．04单位／片〕贴于血平板上，35℃孵育18～24h观看结果。环为阴性。此试验是鉴别A群和其他群链球菌的一个重要试验，A群链球菌为阳性，其他群链球菌为阴性〔对杆菌肽耐受。〔2〕链激酶试验：①原理：A群溶血性链球菌产生链激酶，能激活溶纤维蛋白酶原〔血浆素原为有活性的溶纤维蛋白酶〔血浆素〕而溶解纤维蛋白。②方法：取安康人血浆0．2m1，参加含无菌生理盐水0．8ml的试管中，参加经18～24h2．5g／L CaC12溶液置35℃水浴10min。③结果和意义：血浆先凝固，随后又溶解。在10min溶解凝固血浆为阳性，在15min内完全溶解凝固的血浆为强阳性，24h仍不溶解为阴性。此试验是鉴定A群溶血性链球菌的一个重要试验。〔3〕CAMP试验：①原理：B群溶血性链球菌〔无乳链球菌〕能产生CAMP，CAMP可促进金黄色葡萄球菌溶血素活性，故在血平板上两种细菌交界处溶血增加，形成前头状透亮溶血区。菌接种线垂直接种一短条，两者间隔3mm左右，35℃孵育18～24h观看结果。同时设阳性比照和阴性比照。③结果和意义：与金黄色葡萄球菌接种线相垂直的待检菌接种线近端交接处消灭箭头B群链球菌和其他链球菌的一个重要试验，前者为阳性，后者为阴性〔CAM。〔4〕马尿酸钠试验：①原理：B群链球菌有马尿酸水解酶，可水解马尿酸为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可与FeC13结合，形苯甲酸铁沉淀。②方法：取待检菌纯培育物接种于马尿酸钠培育基，35℃孵育48h，3000r／min离心30min，吸取上清液0．8ml于另一试管中，并参加FeC13试剂0．2m1，马上混匀60～15min观看结果.此试验用于鉴别B群链球菌和其他群链球菌，前者为阳性，后者为阴性。〔5〕Optochin敏感试验： “①原理：肺炎链球菌对Optochin〔盐酸乙基氢化羟基奎宁ethylhydrocupreine HCI〕敏感，它能干扰肺炎链球菌叶酸合成，故Optochin能抑制肺炎链球菌生长。②方法：挑取待检菌密集划线接种在血琼脂平板上，取Optdchin纸片〔5ug/片〕贴在平板上，35℃孵育18～24h观看结果。③结果和意义：抑菌圈直径>18mm为阳性，<15mm为阴性，15～18mm之间应重复试验。此试验用于鉴别肺炎链球菌和甲型链球菌，前者为阳性，后者为阴性。〔6〕胆汁溶菌试验：①原理：胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌细胞膜破损或菌体裂解。②方法：100g/L去氧胆酸钠溶液于血琼脂平板草绿色溶血的菌落上，35℃孵育30min观查结果。试管法：加100g/L去氧胆酸钠溶液0．1ml于1ml草绿色溶血性链球菌和肺炎链球菌血清的培育液的试管中，摇匀后置35℃水浴10～15min观看结果。重要试验，前者为阳性，后者为阴性。〔7〕菊糖发酵试验：①原理：肺炎链球菌能发酵菊糖产酸，使培育基中指示剂转变颜色。②方法：将被检菌接种菊糖发酵管中，35℃孵育18～24h观看结果”甲型链球菌为阴性。〔8〕七叶苷试验：的Fe2②方法：将被检菌接种七叶苷斜面培育基，35℃孵育18～24h。③结果和意义：培育基变黑色为阳性，不变色为阴性。此试验是鉴定肠球菌的重要试验，而链球菌为阴性。〔9〕65g／LNaCl生长试验：①原理：肠球菌具有很强的耐盐力量，能在65g／L NaCl血清肉汤培育基中生长呈混浊。②方法：将待检菌接种65g／L NaCl血清肉汤培育基中，35℃孵育18～24h。〔链球菌耐盐力量较弱不能在此培育基上生长。血清学试验抗链球菌溶血素“O”测定〔即抗“O”试验antistreptolysinO，ASO〕分传统法和胶乳法两种：1〕传统法〔溶血法：A群溶血性链球菌产生的溶血素“O”(SLO)，能溶解红细胞。SLO是一种含-SH基的蛋白质，不耐热，易被氧氧化而失去溶血力量，但参加复原剂可使其恢复溶血力量，SLO有很强的抗原性，人感染2～3周后，机体可产生抗“O”抗体,这种抗体能中和SLO，使之失去溶血力量。↗抗“O”抗体十SLO十RBC→不溶血待检血清

↘无抗O”抗体十SLO＋RBC→溶血②方法：先将病人血清56℃30min灭活，然后将被检血清作1：100、１：500稀释，再按表2-2进展操作。表2-2 ASO测定〔溶血法〕试管号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０比照1:100稀释0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 － － － － －血清〔ml〕1:500稀释－－ － － － 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1血清〔m1〕pH6.5缓冲－0.1 0.2 0.3 0.35 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5液〔m1〕复原溶血素0.250.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25“O”〔m1〕混匀后置37℃水浴15min2％兔红细0.250.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25胞(ml)混匀后置37℃水浴45min血清稀释100 125 166 250 330 500 625 833 1250 2500倍数该血清的ASO单位，＞500U为阳性〔假设取出的试管结果不易观看，则将试管作1500r/min离心３min后再观看。ASO阳性可认为患者近期受溶血性链球菌感染过，可关心诊断风湿热、肾小球肾炎等疾病。低于500U为阴性。〔2〕胶乳法〔胶乳凝集试验：①原理：ASO高滴度的病人血清被适量的溶血素“O”多余抗“O”抗体与ASO胶乳试剂反响，消灭清楚均匀的凝集颗粒〔ASO胶乳试剂系羧化聚苯乙烯胶乳与溶血素“O”共价交联的产物。②方法：先将病人血清56℃30min灭活，然后用生理盐水作1：15稀释。在反响板各孔〔50uO轻摇1min混匀，最终在各孔内分别滴加一滴ASO胶乳试剂，轻摇3min〔18～20℃〕后观看结果。AS≤250Im动物试验(1)透亮质酸酶试验：①原理：A群溶血性链球菌能产生透亮质酸酶〔集中因子质酸，使组织疏松，通透性增高，有利于细菌在组织中集中。②方法：取家兔一只，剪去背部〔10cm×l0cm〕的毛，常规消毒，待检菌24h血清肉汤培育物，3000r／min离心30min，吸取上清液1ml于试管中，参加０.1ml美蓝溶液混匀，用注射器吸取0.2ml注射家兔背部－侧消毒处皮内，另一侧皮内注射仅含美蓝的血清肉汤作比照。注射后20min～lh观看结果。大之倍以上者为阳性，反之为阴性。此试验用于A群溶血性链球菌的鉴定和测定其致病性。〔2〕小白鼠毒力试验：②方法：将待检菌24血清肉汤培育液稀释细菌为10×10／m注射0．5m白鼠腹腔，饲养1～2天内观看小白鼠状况。③结果和意义：假设小白鼠在１～2天内死亡为阳性，解剖作腹腔涂片、革兰染色镜检到菌和甲型链球菌，前者为阳性，后者为阴性。临床意义链球菌属中一溶血性链球菌虽为人体正常菌群，但可引起亚急性细菌性心内膜炎及泌尿道感染，还可引起食物中毒；A群溶血性链球菌可引起化脓性感染，如痈、淋巴管炎、扁机体炎、产褥热及败血症等，也可引起猩红热和变态反响性疾病，如风湿热、急性肾小球肾炎；B群链球菌可引起临产妇女感染和生儿败血症等；C群链球菌可引起脑膜炎、肾炎等；肺炎链球菌可引起大叶性肺炎等；肠球菌最常见的为尿路感染，其中多为医院感染，还引起的重症感染治疗成为麻烦的临床争论课题。三、奈瑟菌属〔一〕目的要求把握脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的鉴定要点。生疏脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的形态和培育特性。〔二〕器材和试剂1．菌种脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。2，培育基巧克力血平板、葡萄糖发酵管、麦芽糖发酵管、蔗糖发酵管、硝酸盐培育基。2 3．试剂氧化酶试剂3％HO2 〔三〕步骤和方法形态观看取脑膜炎患者脑脊液标本和淋病患者标本分别涂片、革兰染色镜检两种菌都为革兰阴性、肾形或豆形、成双排列、相邻边凹面相对的球菌，多位于吞噬细胞内，少数在吞噬细胞外。但慢性淋病性尿道炎患者标本中不少细菌在吞噬细胞外。菌落观看脑膜炎奈瑟菌在巧克力血平板上的菌落呈圆形、凸起、光滑、潮湿、透亮、边缘整齐、直径为2～3mm似露滴状。淋病奈瑟菌在巧克力血平板生长消灭呈圆形、凸起、不透亮、灰白色、直径为0．5～1．0mm的小菌落。生化反响葡萄糖、麦芽糖和蔗糖发酵试验：而使培育基由紫色变为黄色。②方法：将奈琴菌分别接种葡萄糖、麦芽糖和蔗糖发酵管，35℃孵育18～24h。鉴别脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的重要生化反响〔2-。触酶试验：见葡萄球菌生化反响。氧化酶试验：有色的醌类化合物。②方法：用滤纸条沾取被检菌落，用毛细滴管吸10g/L盐酸二甲苯对苯二胺试剂，滴一滴在滤纸条的菌落上〔或直接将试剂滴于培育平板的菌落上，马上观看结果。③结果和意义：马上消灭红色，继而渐渐加深为阳性〔如加盐酸四甲基对苯二胺试剂，呈现蓝紫色为阳性。不变色为阴性。此试验是鉴定奈瑟菌的生化反响。表2-3脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌生化反响触酶 氧化酶 葡萄糖 麦芽糖蔗糖硝酸盐还原脑膜炎奈瑟菌十 十 十 十——淋病奈瑟菌十 十 十 一—一硝酸盐复原试验：生亚硝酸盐，与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，成为重氮苯磺酸与α一奈胺结合为红色的N-α-奈胺偶氮苯碘酸。0．5～1m1参加硝酸盐复原试剂0．1ml后观看结果．③结果和意义：马上或10min内呈红色为阳性，不变色为阴性。如检查有无氮气产生，定奈瑟菌的一项生化反响，奈瑟菌为阴性。〔四〕临床意义要病原菌，可引起淋病和生儿结膜炎。留意事项在临床检验中，常遇到血浆凝固酶阴性的葡萄球菌，不能轻率作出非致病性葡萄球作ASO胶乳凝集试验时，当参加ASO胶乳后，轻摇至本说明规定的时间应马上记录结果，超过规定时间才消灭凝集不作为阳性。如标本发生溶血，高脂、高胆红素、高胆固醇血液，类风湿因子及被细菌污染都会影响试验结果。胶乳试剂不行冻存，宜放4℃环境中，有效期为一年，用前摇匀。室温低于101`min，室温上升10℃，应缩短反响时间1min。附录硝酸盐培育基硝酸钾0．5g酪蛋白酶解物10g酵母膏3g蒸馏水1000m1将上述成分溶解于水，调整pH至7．4，分装试管，每管2～3m1，103.43kP。高压灭菌15min后备用.硝酸盐复原试剂甲液：对氨基苯磺酸0．8g5mol／L醋酸100m1萘酸0．5g5mol／L醋酸100m1临用前取等量甲、乙液混合后即成。七叶苷培育基胰蛋白胨1．5g七叶昔0.1g琼脂粉2g构椽酸铁0.2g蒸馏水100m1将上述成分混会后加热溶解，pH为7．0，一般不需矫正，如其他蛋白胨，则需矫正pH至7．0。分装试管后经103．43kpa高压灭菌15min后，趁热制成斜面后备用。100g/L去氧胆酸钠溶液去氧胆酸钠 10g 95％乙醇 10m1蒸馏水 90m1将上述各种成分溶解混合即成。马尿酸钠培育基肉浸汤〔pH7．4 〕调100ml马尿酸钠 1g将马尿酸钠溶于肉浸汤分装试管并于管壁与液面高度画一横线103.43kP高 灭菌20min后备用。氧化酶试剂〔1〕1％盐酸四甲基对苯二胺水溶液。〔2〕1％盐酸二甲基对苯二胺水溶液。盛于棕色瓶中，置冰箱内保存2周。37 FeC1试剂3FeCl3.6H2O l2g 2％HC1 100m1将三氯化铁溶于100ml的2％盐酸中即成。〔刘伯阳〕试验三 肠道杆菌的分别培育及微生物学鉴定一、肠道杆菌的常规分别培育及鉴定〔一〕目的要求1．把握肠道杆菌的分别培育程序、培育方法、生化反响及鉴定依据。〔二〕器材和试剂菌种 大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、变形杆菌或患者标本。试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、葡萄糖、甲基红、色氨酸、胱氨酸NaOH、对二甲基苯甲醛、尿素、醋酸铅。器材：高压蒸汽灭菌器、量筒、烧杯、搅拌棒、天平、试管、胶塞、电炉子、接种环、接种针、酒精灯。〔三〕步骤和方法1．常见的固体、液体和半固体培育基的配制：〔1〕肉汤培育基制法：称取养分肉汤粉1.8g〔含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g〕参加100ml蒸高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa〔1.05公斤/厘米2〕1210C，维持15～20分钟。冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。制成后的肉汤呈浅黄色，清楚透亮，pH7.1±0.2。肉汤琼脂固体培育基在上述肉汤培育基中参加2～3%琼脂即成。经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即为一般琼脂平板。制作琼脂平板时，每一平皿〔9厘米直径〕需培育基15～20ml。一般琼脂平板用于分别培育生殖细菌；一般琼脂斜面用于纯培育和保存菌种〔琼脂是98℃以上可溶化，45呈酸性，参加液体培育基中可使酸碱度下降pH0.2〕肉汤琼脂半固体培育基0.～0.％琼脂，加热溶化后，分装于小试管10100m，每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。半固体培育基用于检查细菌的动力和细菌菌种的保存。2．细菌生化反响的培育基的配制：吲哚〔靛基质〕试验培育基:取蛋白胨1g，氯化钠0.5g，蒸馏水100ml，调整pH值7.6，为蛋白胨水，即吲哚培育基。接种细菌37℃培育24h后，滴加对二甲基苯甲醛指示剂。对二甲基苯甲醛指示剂的配制：取对二甲基苯甲醛5g，加于戊醇75ml中，置56℃水浴中溶解，取出冷却后，滴加纯盐酸25ml，边滴边摇，以免过热，配成后保存于冰箱中备用。单糖发酵培育基：蛋白胨水100ml，参加1.6％溴甲酚紫酒0.1ml,调整pH值7.6，分装有小倒管的小试管，高压后无菌操作在各管内滴加无菌葡糖或乳糖。甲基红试验培育基:蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.5g，纯葡糖0.5g，溶于100ml蒸馏水中，用滤纸过滤，分装小试管。高压8磅15分钟。接种细菌37℃培育24h后，滴加甲基红指示剂。硫化氢试验培育基:加热溶化2％肉汤琼脂100ml,参加硫代硫酸钠0.25g,混合后15磅20分钟高压灭菌，取出冷却至60℃10％醋酸铅溶液0.5ml，混匀后分装无菌小试管。直立静止，待凝固后即可使用。尿素酶试验培育基:蛋白胨0.1g，0.4％酚红0.3ml,氯化钠0.5g，琼脂2g，磷酸二氢钾0.2g，蒸馏水100ml,葡糖0.1g,20％尿素水溶液10ml。除尿素、葡糖、酚红外，其它成份加热溶解后，调整pH值。参加葡糖、酚红溶液后，混匀于113℃灭菌15分钟。以无菌操作参加过滤除菌的尿素溶液，混匀后分装小试管。高压蒸汽灭菌器使用方法：高压蒸汽灭菌是最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培育用液等都可用此方法消毒灭菌。高压蒸汽灭菌器是细菌室必需的设备，用于培育基及其它物品的灭菌，一般用高压锅。高压锅有立式，卧式之分，也有比较小型的手提式高压锅，适用于小型试验室，由于热源不同，又可分为蒸汽式和电热式，不同的试验室可依据具体状况选用。塞，冷空气排出后，关闭排气阀门；继而开头升压，当到达所需要的压力时，通过调整火焰以不发生过压为好，以免影响消毒物品性状和发生其它意外。各种培育基高压好之后，等自然冷却凝固，方可使用。病原菌分别：平板，也可使用肠道杆菌的选择培育基。右手持灭菌的接种环〔～5，取一接种环混合菌液。在试验台上，尽量使之直立，以免空气中杂菌落入，并靠近酒精灯四周。1线，涂成一薄膜划线时使接种环面与平板外表成30°～40°角，且轻轻接触，以腕力在平板外表滑移，接种环不应嵌入培育基内。区〔／4从区开头划I区〔占剩余平皿面积的13；然后用灭菌接种环从I区开头划II区〔占剩余1／II区开头划Ⅳ区〔平皿的剩余局部。划线完毕后，将平板培育基放回平皿盖内，灭菌接种环，放回接种环架上；于平皿底上用玻璃笔作标记。放37℃恒温箱培育18~24h观看平板外表生长的菌落状态。生化反响：各种代谢产物，借以区分和鉴定细菌。选择平板上典型的菌落进展生化反响。单糖发酵试验〔醇〕有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等。分别将待测物接种于以穿刺法接种于乳糖及葡萄糖发酵管中37℃孵育18－24小时后观看结果。吲哚〔靛基质〕试验某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚〔靛基质。吲哚本身无甲基红试验：红培育基中。硫化氢试验：某些细菌能分解培育基中的含硫氨基酸〔如胱氨酸、半胱氨酸〕生成H2So产生的H２S遇成的H２S量越多，因此可间接地检测细菌是否产生H２S。分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌于2支醋酸铅培育基内。尿素酶试验某些细菌如变形杆菌具有尿素酶，因此，在含有尿素的培育基中，能分解尿素产生氨，使培育基变碱，此时培育基中的酚红指示剂显红色，借此可鉴别细菌。分别将大肠杆菌、变形杆菌接种于两支尿素培育基上。〔四〕结果与争论1．培育基的制备：各种培育基均符合各自的物理性状、颜色和pH值。2．病原菌的分别：单个细菌在平板培育基上生殖成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落〔colony〕由于细菌种类不同，以及培育基的成分不同，菌落特点也不尽一样，这有助于鉴别细菌。因此，应当对菌落进展认真观看，选出目的菌菌落进一步检查，观看要点如下：①大小：以直径〔rnrn〕表示，1mrn左右为小菌落，2～3mm为中等菌落、3mm上为大菌落。②外形：圆形、卵圆形及不规章形。③边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等。④外表：光滑、潮湿、皱纹、枯燥等。⑤隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等。⑥透亮度：透亮、不透亮、半透亮。⑦颜色：无色、白色、黄色、绿色等。3．生化反响结果：单糖试验结果：如细菌生长，则培育基变混浊；糖是否被分解，依据以下现象判定：①指示剂仍为紫色不变，表示细菌不分解该糖，用“－”表示；②指示剂由紫变黄，无气体产生，表示细菌分解该糖，产酸不产气，用“+”表示；③指示剂由紫变黄，并有气体产生，表示细菌分解该糖，产酸又产气，用“⊕”表示。注：液体单糖发酵管是在无糖肉汤或蛋白胨水中参加1％糖类，指示剂常用溴甲酚紫，pH感应界为5.6-6.6，色调由黄→紫。吲哚〔靛基质〕试验结果：37℃孵育24－482－3者为阴性。甲基红试验：37℃孵育24小时观看结果，甲基红培育基变红色者为阳性，颜色不变为阴性。硫化氢试验结果：37℃孵育24小时后观看，穿刺部位呈黑褐色者为阳性，不变颜色者为阴性。尿素酶试验结果：37℃孵育24小时观看结果，尿素培育基变红色者为阳性，颜色不变为阴性。各种细菌的生化反响结果见表3－1表3－1各种细菌的生化反响结果葡糖乳糖吲哚甲基红硫化氢尿素大肠杆菌⊕⊕++－－伤寒杆菌－－－++/-－乙型副伤寒⊕－－++－变形杆菌⊕－－+++〔一〕目的要求

二、大肠埃希菌把握大肠埃希菌的形态、染色特性、培育特性、生化反响及鉴定依据。生疏大肠埃希菌的血清学及动物试验。〔二〕器材和试剂菌种一般大肠埃希菌、EPEC、ETEC、EIEC、EHEC的斜面培育物、大肠埃希菌O157斜面培育物。培育基 克氏双糖铁KI、尿素动力吼跺MI、葡萄糖蛋白胨水、柠檬酸盐琼脂斜面及硝酸盐培育基、SS琼脂平板、中国蓝琼脂平板或麦康凯或伊红美蓝琼脂平板、山梨醇麦康凯琼脂培育基。2试剂EPEC3组多价诊断血清和12EIECOK1及OK2两种多价诊断血清和840～10g／LKOH溶液、30～50g／LH2O溶液。2其他安康豚鼠〔30400、家兔2K左右、无菌手术器械、纱布、无菌滴管、载玻片、生理盐水、革兰染色液等。〔三〕步骤和方法形态观看革兰染色：将被检菌进展涂片革兰染色可见革兰阴性中小杆菌、两端钝圆、多呈单个分散存在。观看鞭毛染色标本片：镜下可见本菌为周毛菌。菌落观看：取一般大肠埃希菌及EPEC、EIEC ETEC、EHEC分别接种在SS琼脂平板上和中国蓝琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板上，经35℃孵育18～24h观看结果。在SS琼脂平板上大肠埃希菌形成红色的、圆形、凸起、边缘整齐的菌落，多数为光滑型菌落。在中国蓝琼脂平板上由于本菌发酵乳糖则形成蓝色凸起的较大的菌落在伊红美蓝琼脂平板上形成紫黑色具有金属光泽大而隆起不透亮的菌落大肠埃希菌0157则需接种在山梨醇一麦康凯〔SMAC〕琼脂平板上，35℃孵育18～24h可见本菌为无色、中等大小的菌落。生化反响SS〔如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色．大肠埃希菌氧化酶试验为阳性。将5种大肠埃希菌分别接种在MIU、KIA、两支葡萄糖蛋白胨水管、一支柠檬酸盐培育基管及硝酸盐培育基管中，经35℃孵育18～24h后，参加相应的指示剂，观看结果〔见3-。表3-2 大肠埃希菌初步鉴定生化反响KIAH2S

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触酶氧化酶硝酸盐复原AA+/-－+/-+－+－－+－+KA－－++－+－－+－－KA－－－+－+－－+－+KA+－+/-+－+－－+－+K：产碱；A：产酸4．血清学反响EPEC的鉴定：取EPEC在KIA上的培育物，分别与EPECOK多价Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组片凝集试验，如快速发生明显凝集，生理盐水比照不凝集，表示细菌具有某型EPECK抗原，需进一步鉴定O抗原。用生理盐水将菌落或菌苔制成108／ml的菌液，加热100℃lh后，再与该分型血清作玻片凝集，发生凝集者，即为具有某型EPEC的O抗原。EIECEPECEIEC所致疾病很象细菌性痢疾柠檬酸盐培育基上能生长，可与志贺菌属相区分。大肠埃希菌0157鉴定：挑取SMAC上的无色的、中等大小的菌落与大肠埃希菌的0157抗血清作乳胶凝集试验。5．动物试验豚鼠角膜结膜炎试验〔示教EIE。方法：用纤维玻棒取EIEC菌液接种于豚鼠结膜羹内或用无菌滴管吸浓菌液滴眼，经18～2４h后观看结果，可见豚鼠产生典型的角膜结膜炎，在角膜上皮细胞内可查见本菌。兔肠段结扎法〔示教2kg左右的安康家兔一只〔１０周龄左右，禁天后固定于试验动物手术台上。乙醚麻醉〔吸入法〕后，以无菌作的方法到剖取出小肠，自回盲未端开头结扎肠段6个，每段5cm长。一段作阳性比照〔注792或791标准肠毒素培育上清2m；一段作阴性比照〔注E.coli K-12w148培育上清2m；其余四段注入待测大肠埃希菌的培育上清2m。注射完毕后，将小肠送回腹腔内，手术部位连续缝合后，无菌纱布包扎手术部位，经18～24h后观看手术结果。检查各段肠内液体蓄积量阴性比照肠段未见肠内有液体阳性比照肠段肠内布满液〔可到达lm1c3。试验组以液体贮留量与肠段长度之比／〕段平均积液量≥1m1／cm3者为阳性。〔四〕临床意义大肠埃希菌为人和动物肠道内大量存在的正常菌群之一生定位转移时才可造成感染。所致疾病可分二类。肠外感染以泌尿系统感染为主。亦可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、术后创口感染等，间或可见本菌引起的败血症和生儿脑膜炎。5ETE、肠致病性大肠埃希菌EPE、肠侵袭性大肠埃希菌EIE、肠出血性大肠埃希菌EHE〕及肠粘附性大肠埃希菌EAggE；三、沙门菌属和志贺菌属〔一〕目的要求把握沙门菌属和志贺菌属细菌的形态及染色特性、生化反响、培育方法及鉴定意义。把握沙门菌属和志贺菌属细菌的血清学鉴定方法。〔二〕器材和试剂菌种福氏、鲍氏或宋内志贺菌斜面培育物、伤寒沙门菌的斜面培育物。培育基S〔或中国蓝或麦康凯〔KI、尿素一动力叩引跺MI。硝酸盐培育基。试剂氧化酶试剂或氧化酶纸片、30～50g／L过氧化氢溶液、柯氏试剂、甲基红试剂、40～100g/LKOH、志贺菌诊断血清〔包括志贺菌属四种多价血清及福氏、鲍氏或宋内志贺菌单价血清、沙门菌诊断血清及a、b、d鞭毛因子血清、伤寒沙门菌诊断抗原、甲型副伤寒沙门菌菌体抗原、乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原、伤寒或副伤寒患者血清或H901、O901免疫血清。其他清洁载玻片、革兰染色液、生理盐水等。〔三〕步骤和方法形态观看〔1〕杆菌，散在分布。〔2〕菌落观看沙门菌属：将本菌接种在朋琼脂平板和麦康凯琼脂平板上经35℃孵育18～24h。由于本菌不分解乳糖，故在SS琼脂和麦康凯琼脂平板上形成无色、半透亮、光滑潮湿、凸起的小菌落，产生H2S的菌落可在SS琼脂平板上形成中心带黑色的小菌落。SS琼脂平板和麦康凯琼脂〔MAC〕平板上经35℃孵育18～24hSS琼脂平板和麦康凯琼脂平板上形成无色透亮的、中等大小的菌落。除宋内志贺菌易形成较大的菌落，呈微红或玫瑰红色，其他细菌菌落均为光滑型菌落。在血平板上志贺菌形成灰白色、半透亮、外表光滑、潮湿、边缘整齐、中等大小而不溶血的菌落。3、生化反响初步鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在KIA、MIU培育基上、硝酸盐培育基上，经35℃孵育18～24h，同时做触酶试验。其结果见表3-3。表3-3 志贺菌和沙门菌的根本生化反响KIAH2S

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氧化酶触酶硝酸盐复原志贺菌KA-／+一一+/-一－十＋伤寒沙门菌KA－+/-＋一一一十十甲型副伤寒菌KA十-/+＋一一一十＋乙型副伤寒菌KA十十十一一一＋十3-4。表3-4志贺菌属种间鉴别生化反响痢疾志贺菌福氏志贺菌 鲍氏志贺菌宋内志贺菌半乳糖苷酶－— －＋鸟氨酸脱羧酶－— －＋发酵糖类乳糖－— －－＃甘露醇－＋ ＋＋蔗糖－— －－木糖－— －－＃个别菌株可以消灭缓慢发酵血清学试验志贺菌属的分型鉴定：凡生化反响符合志贺菌属者均需作血清学鉴定。取一环志内消灭肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。假设待回菌与志贺菌四种多价诊断血清玻片凝集试验阳性者，则选用最常见菌组作进一步定型鉴定。沙门菌属的分型鉴定：假设生化反响及形态学检查疑为沙门菌时，可选用沙门菌A～F组多价“O”时应以生理盐水作比照。血清凝集试验，在5～30min内不消灭凝集者可确定为阴性。但假设生化反响比较典型，应考虑选用做Vi凝集试验。假设凝集,则用无菌生理盐水将菌洗下，制成深厚的悬液，加热100℃30min，再与A～F组多价“O”诊断血清做凝集试验。4 7 1 8 2 9 1 3 10 假设与A～F组多价“O”血清发生凝集，应再与代表8个O群的沙门菌单价因子血清〔O2凝集为A群，O凝集为B群，O凝集为C群，O凝集为C群，O凝集为D群，O、O 、O 4 7 1 8 2 9 1 3 10 1911O 凝集为E群，O凝集为F群〕分别作玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选1911用本地区最常检出菌型的相应血清作玻片凝集反响。假设以确定为哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第Ⅰ相抗原，然后检查第Ⅱ相抗原，最终确定该菌种属于哪一型沙门菌。〔或物中毒、菌血症和败血症。很多沙门菌只引起胃肠炎，且更多的只对动物致病。本菌属均可致细菌性痢疾或慢性腹泻。慢性患者和恢复期带菌常见。肥达试验目的要求①把握肥达试验的原理，操作方法及结果推断。②生疏其临床意义。器材和试剂①菌种 感染伤寒沙门菌或副伤寒沙门菌的模拟血清标本。②试剂 伤寒沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原，甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原及乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原。③其他 试管、40孔试管架、1ml吸管、3rnl吸管、无菌滴管、橡皮乳头、37℃或45℃水浴箱等。步骤及方法①原理人类感染伤寒或副伤寒沙门菌后，约经1～2周即可在血清中出拢抗体〔凝集素现象。此试验常用于伤寒、副伤寒的关心诊断。②试验方法预备4713.8ml及被检血清０.２ml,混匀，即为1：20稀释。然后取出2ml按每管0.5m1分别放入各排小试管ml,1：40稀释，再吸取此稀释度血清2ml,按每管0．5ml连续稀释到各排小试管第6支试管为止，第7支小试管只参加0.5ml生理盐水做阴性比照。然后按表3-5操作。表3-5血清学试验〔肥达试验〕方法试验管〔每管0.5m1稀译血清〕比照管1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640生理盐水〔0.5m1〕O抗原0．5 0．5 0．5 0．5 0．5 0．50．5H抗原0．5 0．5 0．5 0．5 0．5 0．50．5PA抗原0．5 0．5 0．5 0．5 0．5 0．50．5PB抗原0．5 0．5 0．5 0．5 0．5 0．50．5血清最终稀释度1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280－45℃水浴箱中2h或37℃水浴箱4h并记录结果。度以4＋、3＋、2＋、十、一符号记录。4＋：上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。3＋：上清液澄清度达75％，大局部细菌凝集成块沉于管底。2＋：上清液澄清度达5０％，约50％细菌集成块沉于管底。25％。一：液体均匀混浊，无凝集块。以呈现2＋凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。一般认为，伤寒沙门菌O抗体凝集价在1：80以上，H抗体在1：1601：80以上才有诊断意义。临床意义肥达试验用于关心诊断伤寒及副伤寒病。临床上应以两次标本〔疾病早期期或中期〕的凝集价有4倍增高作为近是否感染该病的指征。单份血清的凝集价应达1：160以上才有参考价值。伤寒病人的O凝集素常较H凝集素消灭早，存在于血清内的时间较短，H凝集素则产生较慢，但效价较高，存在的时间亦较长。曾患过伤寒病或曾接种过伤寒菌苗，近又感染流行性感冒者可产生高滴度的一凝集素及较低的O凝集素，此种反响称回忆反响。沙门菌属细菌各菌种之间有某些共同抗原，在凝集试验中可能消灭肯定的穿插凝集现象。留意事项①结果观看时先不要振荡试管，先把试管举起以观看试管内上清液和下沉凝集物，然应首先观看比照管，此管应呈“一”〔即不凝集。②“H”凝集呈絮状，以疏松之大团沉淀于管底，轻摇试管即能荡起,而且极易散开。③“O”凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。四、小肠结肠炎那尔森菌〔一〕目的要求把握小肠结肠炎那尔森菌的形态染色特性、生化反响及动力温度试验。〔二〕器材和菌种菌种小肠结肠炎那尔森菌斜面培育物。培育基麦康凯琼脂平板、KIA、MIU培育基、半固体培育基、葡萄糖蛋白胨水、鸟氨酸脱羧酶微量管。试剂氧化酶试剂或氧化酶纸片。其他25℃和37℃孵箱、革兰染液、载玻片、生理盐水等。〔三〕步骤和方法形态观看将小肠结肠炎那尔森菌涂片革兰染色，显微镜下检查见革兰阴性短小杆菌偶有两极浓染。菌落观看将本菌接种在麦康凯琼脂平板上经25℃孵育24h色半透亮的较小的菌落。生化反响将本菌接种在KIAMIU管中经37℃和25℃孵育１８～24h后，同时做氧化酶试验和触酶试验，其结果见表3-6。表3-6 小肠结肠炎耶尔森菌的生化反响KIAH2S

MIU动力 吲哚 脲酶

触酶氧化酶K A －－ ＋(25℃) -/+ ＋ ＋ － ＋(25℃)－(37℃) －(37℃)K：产碱；A：产酸动力温度试验由于本菌在不同温度下产生动力与否不同，可将细菌接种２支半2525℃孵育18～24h35℃孵育18～24h的半固体培育基则动力试验阴性。也可将本菌接种在两个麦康凯琼脂平板上分别放25℃和37℃育１８～24h，然后用悬滴法或压滴法检查动力。结果觉察本菌在25℃时产生动力，37℃时无动力产生。〔四〕临床意义小肠结肠炎那尔森菌分布广泛，对人和动物均有感染性，属人畜共患病原菌之一。人〔乳品或其他食物龄。临床类型有：①胃肠炎型，即小肠结肠炎，约占本菌感染的三分之二，多见于儿童，特别是乳幼儿，以急性腹泻、腹痛和发热为主要病症；②未端回肠炎、阑尾炎及肠系膜淋巴结炎型，多见于学龄前儿童及成年人，呈急腹症样发病；③结节性红斑型，成人多见：④关节炎及腱鞘炎型大脓肿的苦痛，成人多见；⑤败血症型，多发生于免疫功能受抑制的患者。附录1．克氏柠檬酸盐培育基柠檬酸钠3．0g葡萄糖0．2g酵母浸膏0．5g盐酸半胱氨酸0．1g氯化钠5．0g磷酸二氢钾1. 0g酚红0.012g硫代硫酸钠0.08g柠檬酸铁铵0．4g琼脂15．0g蒸馏水1000.0ml(1)将上述成分混合溶解后调pH至6．7，分装试管，于103．43kpa高压15min灭菌。(2)制成斜面，使斜面为3.8cm，底层为2cm。(3)37℃孵育至7天斜面变红为阳性。2．SS〔shigellasalmonella〕琼脂〔强选择培育基〕牛肉膏5g 际胨5g胆盐8．5g 柠檬酸钠10～14g硫代硫酸钠8．5～10g 柠檬酸铁0．5g琼脂18g 乳糖10g1g／L煌绿溶液0．33ml 5g／L中性红水溶液5ml蒸馏水1000mlpH5mi〔无需高压灭菌，待冷至50℃左右倾注平板。用于粪便标本中肠道致病菌的分别。3．麦康凯〔MacConkey〕琼脂〔弱选择培育基〕蛋白胨20g 乳糖10g胆盐5g NaCl5g琼脂20g 5g/L中性红水溶液5ml蒸馏水1000ml除乳糖、中性红外，其余成分加热溶化，调pH7．2，参加乳糖、中性红溶液，高压灭菌68．95kPa l5min，冷至50℃倾注平皿。用于粪便标本肠道致病菌的分别。〔一〕目的要求

五、枸橼酸杆菌属把握拘椽酸杆菌属细菌的形态染色特点，生化反响及鉴定依据。生疏其培育特点.〔二〕器材和试剂菌种弗劳地枸椽酸杆菌或无丙二酸盐枸椽酸杆菌斜面培育物。培育基SS琼脂平板或麦康凯琼脂平板，KIA、MIU、丙二酸钠琼脂斜面，侧金盏花醇微量管，葡萄糖蛋白胨水。试剂柯氏试剂、40～100g/LKOH溶液。〔三〕步骤和方法形态观看将枸椽酸杆菌进展涂片革兰染色，镜下可见本菌为革兰阴性杆菌，单个或成双排列，通常无荚膜，具有周鞭毛，运动活泼。菌落观看将本菌接种在SS琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，经过35C孵育18～24h，形成乳糖发酵的菌落。在SS琼脂平板上形成元色、淡黄色较混浊，有或无黑色中心的菌落，在麦康凯琼脂平板上的菌落与SS琼脂平板上的菌落一样但无黑色中心。假设将本菌培育在HE平板上，菌落为蓝绿色。生化反响氧化酶和触酶试验：符合肠杆菌科和枸椽酸杆菌属细菌的根本特性。氧化酶阴性，触酶阳性。属根本特性生化反响：将枸橡酸杆菌属细菌接种于葡萄糖发酵管、硝酸盐试验管、KIA培育基上。可见葡萄糖发酵产酸产气，复原硝酸盐，KIA：AA＋＋或KA＋＋。属的鉴定：将菌种接种于以下生化反响管中，依据表中所列结果与沙门菌属和爱德华菌属鉴别〔3-。表3-7生化试验枸檬酸杆菌枸椽酸杆菌属与类似菌属的鉴定沙门菌属爱德华菌属卜半乳糖育酶 十亚属1 亚属3— 十一赖氨酸脱羧酶 一十 十十吲 哚 一／＋— 一十丙二酸盐利用 一／十— 十一甘露醇发酵 十十 十一柠檬酸盐利用 十十 十一明胶液化 一— 十一属内种的鉴定需依据侧金盏花醇和丙二酸盐二个反响。弗劳地枸橼酸杆菌侧金盏花醇〔一；丙二酸盐-/；无丙二酸盐枸椽酸杆菌侧金盏花醇〔一，丙二酸盐〔一而异型枸橼酸杆菌两个试验均为阳性。〔四〕临床意义枸椽酸杆菌为肠道正常菌群，亦是条件致病菌。常致尿道感梁、菌血症、败血症和肺炎、腹膜炎、创伤感染、生儿脑膜炎、脑脓肿。是血库血及血浆的常见污染菌。六、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属〔一〕目的要求把握肠杆菌属细菌的形态与染色特点，生疏其培育方法、生化反响特性及鉴定意义。把握沙雷菌的形态与染色特点，生疏其培育方法，生化反响特性及鉴定意义。〔二〕器材和试剂菌种肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、粘质沙雷菌。培育基血琼脂平板、麦康觊琼脂平扳或中国蓝琼脂平板、MIU、KIA、葡萄糖蛋白胨水〔供甲基红试验和V-P试验用、柠檬酸盐琼脂斜面或微量管、苯丙氨酸培育基。试剂革兰染色液、荚膜染色液、柯氏试剂、甲基红试剂、40～400g／LKOH溶液。其他生理盐水等。〔三〕步骤和方法形态观看革兰染色：将三种菌分别进展革兰染色，结果为：肺炎克雷伯菌为革兰阴性，杆菌，也有呈球杆状，呈单个或5～6个相连，无芽胞，无荚膜。荚膜染色：将三种细菌分别进展荚膜染色可见：肺炎克雷伯菌的菌体呈卵圆形2～3倍。产气肠杆菌也有明显的荚膜，而沙雷菌属除臭味沙雷菌有微荚膜外均无荚膜。菌落观看将三种细菌分别接种在血琼脂平板和麦康凯或中国蓝琼脂平板上，35℃孵育18～24h观看结果。肺炎克雷伯菌在血琼脂平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌乳糖发酵产酸的菌落，即红色、较大、混浊、凸起的粘液型菌落，较大肠埃希菌大。产气肠杆菌在血琼脂平板上，形成大而潮湿、灰白色、粘液状、不溶血，假设培本菌为大而潮湿、白色的菌落。沙雷菌养分要求不高，在一般琼脂培育基上即可生长。在血平板上形成光滑、潮湿、圆形、中心呈颗粒状的菌落，大多数不透亮，有些呈白色、粉色、红色。色素产生在室温下明显，而35℃产生不良。生化反响肠杆菌科细菌种类较多，鉴定时应按科-属-种的次序进展。首先用形态、葡萄糖氧化或发酵试验、氧化酶试验、触酶等特性鉴定到肠杆菌科再将细菌分别接种于苯丙氨酸脱氨酶微量管、葡萄糖蛋白胨水〔VP试验用〕中及MIU、KIA、3124后观看结果〔3-。表3-8 肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌及粘质沙雷菌生化反响细菌名称鸟氨酸脱氢酶

KIA乳酸 产气

MIU

柠檬苯丙氨盐酸酸酶肺炎克雷伯菌一 十 十 十 一一 一〔＋〕 － ＋／一产气肠杆菌 十 十 十 十 一十 一〔＋〕 一 十粘质沙雷菌〔＋＋＋／一 一 十一一／十〔十〕 一 十肺炎克雷伯菌吲哚阴性和不能在5℃和10C10℃生长，不能在5℃生长，据此将细菌分到种，假设确定为肺炎克雷伯菌，可增做丙二酸盐试验，种内鉴定见表3-9。表3-9 肺炎克雷伯菌属种的鉴定试验肺炎亚种肺炎克雷伯菌臭鼻亚种鼻硬结亚种吲哚－－－甲基红一十十柠檬酸盐＋一／＋一丙二酸盐十一＋沙雷菌属在临床上多见有粘质沙雷菌和液化沙雷菌别。粘质沙雷菌不发酵阿拉伯糖和木糖，而液化沙雷菌发酵阿拉伯糖和木糖。动物试验可承受兔肠段结扎试验等方法测定，方法原理同大肠埃希菌的ETEC肠毒素测定。〔四〕临床意义克雷伯菌属为四周环境及人呼吸道的常居菌群，也是常见的条件致病菌。本菌属也是国内医院感染中最多见的细菌之一95％为肺炎克雷伯菌肺炎亚种，它能引起婴儿严峻的肠炎，也致肺炎、脑膜炎、败血症、腹膜炎、外伤感染及成肠杆菌属为常见环境菌群，也是条件致病菌。常从尿路感染、败血症和其他临床疾检出大肠埃希菌可视为被粪便污染的指标；假设为产气肠杆菌则多是原来存在自然界中。阴沟、产气、聚团、日沟维等肠杆菌均为条件致病菌，板崎肠杆菌一般无临床意义，偶可引起生儿脑膜炎或败血症。河生和中间型肠杆菌尚未从人的感染中分别到。沙雷菌属为水和土壤的常见菌。原认为无致病性，近年来有报道可引起肺部感染、菌。〔一〕目的要求

七、变形杆菌属和摩根菌属意义。

把握变形杆菌属细菌的形态与染色特点，生疏其培育方法，生化反响特点及鉴定把握摩根菌属细菌的形态与染色特点，生疏其培育方法，生化反响特点及鉴定意义。〔二〕器材和试剂菌种 一般变形杆菌和摩根菌的斜面培育物。培育基MIU、KIA、养分琼脂平板、SS琼脂平板或麦康凯琼脂平板、鸟氨酸脱羧酶微量管、柠檬酸盐斜面培育基、苯丙氨酸脱氨酶微量管。试剂 酚红指示剂、柯氏试剂。其他 生理盐水。〔三〕步骤和方法形态观看将两种菌斜面培育物分别进展涂片，革兰染色结果为：一般变形杆菌为革兰阴性杆菌，两端钝圆，有明显的多形性，在肯定条件下可形成球杆状或丝状；无芽胞和荚膜，摩根菌的形态与变形杆菌类似。鞭毛染色：将两种细菌进展鞭毛染色结果为：一般变形杆菌为周身鞭毛。而摩根摩根菌30℃以上不产生鞭毛。菌落观看 将两种细菌斜面培育物分别接种于养分琼脂平板和SS琼脂平板上，经35℃18～24h孵育，观看结果为：一般变形杆菌：在养分琼脂平板上有云雾状薄膜呈波浪状迁徙生长现象，而在SS琼脂平板上，经35℃孵育18～24h则形成无色圆形的中等大小的乳糖不发酵菌落，常常为有黑色中心的菌落。摩根菌：在养分琼脂平板和SS琼脂培育基上生长，不形成迁徙生长现象。生化反响依据菌落特征，结合涂片染色为革兰阴性的多形性杆菌及氧化酶试验阴性。挑取SS琼脂上的可疑菌落分别接种在MIU、KIA及苯丙氨酸脱氨酶微量管、鸟氨酸脱羧酶微量管中，可将细菌鉴别到种，其结果见表3-10。表3-10 变形杆菌及摩根菌属的种间鉴别KIAH2S

MIU动力吲哚 脲酶

苯丙氨酸 脱氨酶 一般变形杆菌KA十一十十十十一奇异变形杆菌KA十＋十一十十十产粘变形杆菌KA十十〔3天〕十一十十一摩根菌 KAd一十一十十十K：碱性；A：酸性；十：90％以上菌株阳性；d：不定；3天：3天后阳性。〔四〕临床意义4个种，即一般变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌和潘纳变形祆菌。可致尿路感染、胃肠炎、肾炎、心内膜炎、、败血症、脑膜炎等。其中产粘变形杆菌与人类感染无关。摩根菌属也为条件致病菌，可引起各种感染，常见于腹膜和尿路感染，本菌属是医院感染中的重要病原菌之一。附录荚膜肿胀试验将经35℃孵育18～24h21滴，再加抗血清1接种环。混合后，加盖玻片，于油镜下观看，阳性者在菌体四周消灭较大的空白圈，同时做不加抗血清的比照加以比较。八、弧菌属、弯曲菌属和螺杆菌属〔一、弧菌属目的要求〔１〕把握弧菌的形态，培育方法及在常用培育基上的生长现象及生化反响。生疏弧菌的鉴定试验及快速诊断。了解弧菌的常用培育基及制备方法。器材和试剂菌种不凝集弧菌、副溶血性弧菌。4、SS琼脂平板，KIA、MIU培育基，无盐蛋白胨水，含盐〔70g，100g／LNaCL〕蛋白胨水、血琼脂培育基。试剂3%400g/LKOH、5g/L去氧胆酸钠水溶液，浓硫酸，生理盐水。其他霍乱弧菌、副溶血性弧菌革兰染色形态示教片。步骤和方法〔1〕形态观看在显微镜油浸镜下观看霍乱弧菌的形态示教片，其形态呈弧形或逗点状，排列似“鱼群”样，染色为革兰阴性。副溶血性弧菌的形态呈弧形、棒状、卵圆形等多形性，排列不规章，散在或成对；为革兰阴性。压滴法观看动力：运动活泼。〔菌落观看霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中呈均匀混浊在碱性琼脂平板上可形成较大菌落外表光滑或有微细颗粒。副溶血性弧菌在副溶血性弧菌选择平板上菌落大小1～2mm绿色、中心较深，无粘性。〔3〕生化反响将霍乱弧菌接种在KIA、MIU等培育基中，经35℃孵育18～24h观看结果，见表3-11。K1A

表3-11 霍乱弧菌生化反响MIU 其他斜面底层产气H2S— 十 一 一

动力吲哚脲酶十 十 一

氧化酶粘丝试验十 十将副溶血性弧菌接种在KIA、MIU及各种蛋白胨水培育基中，经35℃孵育18h观看结果，见表3-12。表3-12 副溶血性弧菌生化反响K1A

MIU

蛋白胨水斜面底层产气H2S— 十 一 一

动力吲哚脲酶 无 70g/LNaCl 100g/LNaCl十 十 一 一 十 一①粘丝试验：用于测定霍乱弧菌形成粘丝的特性。将5g／L去氧胆酸钠水溶液和霍乱弧菌的菌落混匀制成深厚悬液，1min内悬液由混浊变清，并变得粘稠，用接种环挑取时可以拉出丝来，为阳性。霍乱弧菌古典生物型和ELTor生物型均呈阳性反响。35℃孵育18～24h后，在培养基中参加浓硫酸，混合后，呈红色者为阳性反响。霍乱弧菌为霍乱红试验阳性，但其他非致病性弧菌也有阳性，故无特异性。⑷霍乱弧菌的分型试验〔玻片凝集试验2～3min后，观看是否消灭凝集现象，凝集者为阳性，盐水比照不应消灭凝集。②噬菌体分型试验：取被检菌2h肉汤培育物，用接种环分别均匀涂于两个一般琼脂平5个分型噬菌体VPVP〕原液10／m，另一个滴加分型噬菌体VP1VP〕稀释液16／m520后观看最终结果。全裂解、大局部裂解、半裂解、不透亮裂解、弱裂解和不同量的噬菌斑者均为阳性。可疑和不裂解者为阴性。第I〔1／mELTo19／ml〕对两型均能裂解。24h1im37℃水浴2h50％红细胞被溶解者为溶血试验阳性，ELTor生物型大多数为阳性，古典生物型溶血试验阴性。⑸副溶血性弧菌的鉴定①嗜盐试验：取肉汤或斜面培育物，分别接种于70g／L的NaCl肉汤或无盐肉汤培育基中，经37℃18～24h孵育，副溶血弧菌在有盐肉汤中生长，在无盐肉汤中不生长。②Kanagawa神奈川现象试验：用接种环刮取少量颖斜面培育物，接种于我妻血琼脂〔约1cm37℃经24～48hKangawa可见到溶血环。⒋临床意义弧菌属目前共有3511主要有两种形式，一种为肠道感染，引起胃肠炎或腹泻，如霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血性弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌等属；另一种为非肠道感染，如败血症、中耳炎、染，如霍乱弧菌还可引起败血症、外伤感染、中耳炎、肠道感染，副溶血性弧菌也可引起中耳炎或外伤感染。⒌留意事项⑴霍乱弧菌培育，如为急性期病例的粪便标本通过碱性蛋白胨水增菌时，必需在6～8h4h制动试验进一步移种平板作其次次增菌。落，其余半个菌落作进一步移种纯培育用。品中含有大量溶藻弧菌和少量副溶血性弧菌本菌耐酸性弱，不易在呕吐物中检出，因此，一般不采患者呕吐物作该菌检验。〔二〕空肠弯曲菌⒈目的要求⑴把握空肠弯曲菌的形态染色性和培育特性。⑵生疏空肠弯曲菌的生化反响及鉴定试验。⒉器材和试剂⑴菌种空肠弯曲菌。⑵培育基Skirrow弯曲菌培育基、改进Campy一BAP琼脂、甘氨酸培育基、快速尿素酶培育基、35g/LNaCl肉汤。⑶试剂氧化酶试剂３％过氧化氢、茚三酮试剂。⑷其他醋酸铅纸条。⒊步骤和方法⑴形态观看取培育物涂片，革兰染色镜下观看：该菌为革兰阴性细小杆菌，菌体呈S形，逗点状或“海鸥展翅”形，有的呈螺旋形。悬滴法观看动力，运动活泼呈投镖样的螺旋运动。⑵菌落观看将空肠弯曲菌接种于Skirrow弯曲菌琼脂平板或种于改进的Campy一BAP琼脂上，目前常用后者，置5％02、85％N2、10％CO2气体环境，42℃孵育24～48h，空肠弯曲菌的菌落为扁平、灰白潮湿，边缘不整齐，沿接种线集中生长；有的呈圆形，凸起，半透明，有光泽似针尖状细小菌落。⑶生化反响①取菌作氧化酶、触酶试验，并接种KIA，醋酸铅纸条，10g／L甘氨酸和35g／LNaC1培育基，放42℃孵育48h后观看H2S的产生及生长试验，同时分别置25℃与42℃环境作生长试验，各生化反响，见表3-13。表3-13空肠弯曲菌生化反响氧化酶触酶H2S产生生长试验十KIA十 一醋酸铅纸条十10g/L甘氨酸35g／LNaCl十 一25℃42℃— ＋②马尿酸钠水解试验：取10g/L马尿酸钠水溶液4ml制成105／ml的细菌悬液，放微需氧条件下，经37℃反响2h，离心后取上清液，参加茚三酮试剂０．１ml，呈紫色为阳性，无色或淡蓝色为阴性。⒋临床意义空肠弯曲菌是禽类肠道正常菌群，人接触或通过食物、水传染，可引起急性肠炎，或儿感染。其主要致病物质为霍乱样肠毒素。⒌留意事项分别弯曲菌的标本应马上接种，避开露在空气、热或枯燥环境中，如不马上接种应４％～８％氧气和５％10C长最好，最适温度为42～43℃，所以置４３℃孵育2４～4８h易分别到空肠弯曲菌。