环脂肽类抗生素研究进展

环脂肽类抗生素研究进展【摘要】2003年新抗生素达托霉素的上市，使环脂肽类化合物成为医药研发的热点。本文跟踪了国外环脂肽类抗生素研究的最新进展，从结构特征、物化性质、抗菌活性，构效关系以及生物合成等方面对该类抗生素进行了小结，并对达托霉素的药效学研究和临床应用作了重点介绍。

【关键词】环脂肽类抗生素；达托霉素；抗菌活性；生物合成；药效学

ABSTRACTCyclo-lipopeptidecompoundshadbecomethefocusofresearchanddevelopmentofpharmaceuticalindustry,sincenovelantibiotics,daptomycin,launchedin2003.Thisarticlereviewedlatestprogressesoflipopeptideantibioticsfamily,includingchemicalstructure,physicochemicalproperty,antimicrobialactivity,structuralactivityrelationshipandbiosynthesis.Moreover,pharmacodynamicsresearchandclinicalapplicationofdaptomycinwerealsointroduced.

KEYWORDSCyclo-lipopeptideantibiotics;Daptomycin;Biosynthesis;Antimicrobialactivity;Pharmacodynamics

2003年由美国Cubist公司研制的新抗菌药达托霉素(商品名：Cubicin)，获得美国FDA(FoodandDrugAdminstration)批准用于治疗革兰阳性菌引起的复杂皮肤感染和结构性皮肤感染，并先后在美国、德国、英国和荷兰上市(http:///citrix/nfuse17/frameset/asp，2006-12-8)。2006年美国FDA又批准了达托霉素的新适应证，用于治疗由金葡菌引起的心脏感染和菌血症。

随着高致病耐药菌，如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等的不断出现，临床上对新抗生素的需求变得十分迫切。达托霉素对以上耐药菌均有很好的杀菌效果，且制剂用药方便，毒副作用小。它的上市为临床医生提供了一种新的治疗方案，成为“病原菌最后一道防线——万古霉素”的最佳替代品；更具意义的是，达托霉素作为环脂肽类抗生素家族的第一个产品，其化学结构和作用机制不同于已有所有类别的抗生素，是近四十年来继口恶唑烷酮类抗生素后，应用到临床的唯一新结构类别抗生素。

达托霉素在临床上的显着优势，以及其全新的结构类别，使得环脂肽类化合物(如：A21978，calcium-dependentantibiotic/CDA，friulimicins，amphomycins等)成为当今新抗生素筛选的热点。本文跟踪了国外环脂肽类抗生素研究的最新进展，并对达托霉素的药效研究和临床应用做了重点介绍。

1环脂肽类抗生素的结构特征与物化性质

环脂肽类抗生素的结构特征［1］

环脂肽类抗生素是一类分子中具有环状结构的脂肽类化合物，其结构特征为：分子中包括一个十肽环和一个1～3个氨基酸组成的尾链，在尾链的N末端还连有脂肪酸。十肽环由氨基酸和非蛋白质源氨基酸(如：Orn，OmAsp，3mGlu等)按照酰胺键或酯键构成肽环或羧酸肽环，典型的化合物结构如所示。

自20世纪50年代至今，已经发现的环脂肽类抗生素近十余种()。根据其结构是否严格按照酰胺键形成肽环，可以分为环肽类(cyclicpeptides)和环缩肽类(cyclicdepsipeptides)。环缩肽类化合物的肽环中，除正常的酰胺键外，还具有由C端氨基酸羧基和氨基酸(Thr或Ser)羟基形成的酯键。

除了具有相同的环脂肽结构外，环脂肽类抗生素在其十肽环的相同位置上还具有相同或类似的氨基酸残基。例如：A21978C、A54145和CDA在肽环的相同位置都含有Thr、3mGlu或Glu。Amphomycins、friulimicins、laspartomycins和glycinocins在相同的位置上含有D-Pip3和Pro11。这些结构上的类似导致环脂肽类化合物具有相同或相近的生物活性，即对革兰阳性菌有很好的抗菌效果。

环脂肽类抗生素的物化性质

环脂肽类抗生素分子结构中既含有亲水性氨基酸，又含有脂链以及疏水性氨基酸，这就决定了其两亲性的生物学特性。环脂肽类抗生素多为酸性，在中性pH下分子带负电荷，因而具有很好的水溶性。同时，脂链和疏水性基团的存在，使其具有很好的脂溶性，容易与细菌磷脂层反应。脂肽类化合物两亲性的物化性质，决定了其良好的抗菌效果，同时也为利用反相液相和离子交换技术等方法，分离纯化组分提供了理论依据。

环脂肽类抗生素的抗菌活性

环脂肽类抗生素对于革兰阳性菌有很好的抗菌效果，其抗菌活性在不同程度上均依赖于Ca2+浓度。

A54145对于葡萄球状菌、链球菌、梭状菌和肠球菌均有很好的抗菌效果；同时，其Glu12类似物对金葡菌和化脓链球菌也有很好的抗菌效果［2］；amphomycin在10μg/ml的浓度下可以抑制蜡状芽孢杆菌(Bacil-luscereus)的生长，它的作用机制为干扰细胞肽聚糖的合成。对于真核细胞，amphomycin可以干扰长醇磷酸化来抑制单糖脂的生成。FriulimicinB(HMR1034)对金葡菌、表葡菌、溶血葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌和粪链球菌等多种致病菌均有抗菌活性，其抗菌活性约为达托霉素的%～50%［1，3］。

在缺乏Ca2+时，达托霉素和A54145的抗菌活性很小或几乎没有。只有Ca2+浓度为/L时两者的抗菌活性才达到最大［2］。CDA达到其最大抗菌活性所需的Ca2+浓度为16mmol/L。圆二色谱和核磁共振研究结果显示，达托霉素与Ca2+结合后结构发生改变，增加其分子的两亲性减少带电荷，使其更有利于与细菌磷脂反应［4］。此外friulimicinB和amphomycin的抗菌活性也存在Ca2+依赖的现象。

环脂肽抗生素的构效学

通过对环脂肽类抗生素A21978C、A54145、amphomycin和laspartomycin的研究发现，酰基链的长度对其抗菌活性影响显着。对于A21978C和A54145，当碳链长度分别为12～13和14时，其体外的抗菌活性最强。但同时也发现，当碳链长度超过11时，其体内的毒性也显着增强。对于amphomycin和laspartomycin抗菌效能最强的碳链长度为15～17。以上四种抗生素的酰基脂肪链均可以被其他疏水基团代替。有研究表明，达托霉素和laspartomycin内环结构中的Asp残基对其抗菌活性有着重要的作用。当达托霉素的Asp7、Asp9和laspartomycin的Asp5、Asp7被其他基团替代后，其抗菌活性随之消失了。这表明Asp很可能是Ca2+结合的位点［1］。

基于对环脂肽类抗生素构效学的研究，人们通过结构改造的方法来增强该类抗生素的抗菌活性，减少体内毒性。目前此方面的研究集中在酰基尾链和外围氨基酸的化学修饰上。达托霉素本身就是化合物A21978C化学修饰的产物。A21978C的系列物中，随着酰基侧链的改变，其毒性显着变化。A21978C通过微生物转化的办法，将酰基尾链上的基团被癸酸替代，生成无毒的达托霉素以作药用［5］。

2环脂肽类抗生素的生物合成

环脂肽类抗生素的NRPSs生物合成

环脂肽类抗生素属于微生物次级代谢产物，经细胞非核糖体途径合成。非核糖体途径的肽合成不依赖mRNA为模板，也不以tRNA为载体，而是通过非核糖体肽链合成酶(non-riosomalpeptidesynthetases，NRPSs)识别特定的氨基酸并连接成多肽链。因此，NRPSs同时具有酶和模板的特性。

NRPSs由一系列顺次排列的组件(modules)构成，每个组件又由不同的结构域构成。这其中主要包括识别、激活氨基酸的腺苷酰化结构域(adenylation/A-domain)，将氨基酸通过硫酯键连接在酶分子的巯基结构域(thiolation/T-domain)和通过肽键将氨基酸连接在肽链上的缩合结构域(condensation/C-domain)。此外还包括负责氨基酸修饰的差相异构化结构域(epimerase/E-domain)、甲基化结构域(methylation/M-domain)和负责解离终产物的硫酯结构域(thioesterase/Te-domain)。NRPSs每个组件负责完成一个反应循环，按照CAT的顺序，将特定的氨基酸连接成线状肽链，然后通过Te环化，并将产物从酶分子中释放，最终完成这种有序的环脂肽生物合成［6］。

通过对达托霉素，A54145、CDA以及friulimicin等环脂肽抗生素NRPSs合成基因序列的研究发现，对于达托霉素、A54145和CDA，除了不同基因簇编码的NRPSs负责整合特定的氨基酸(如所示)外，dptA、lptA和cdaPS1编码的NRPSs亚基中还负责将脂肪酸连接到肽尾氨基酸上，dptD、lptD和cdaPS3还负责线状肽链的环化和产物的释放；对于Friulimicin，编码的NRPSs基因序列由pstA和pstB构成，其中pstA负责编码NRPSs的腺苷酰化结构域、巯基结构域和硫酯结构域，pstB则负责编码缩合结构域［7～9］。

通过对NRPSs结构功能及合成基因的研究，可以采用重组NRPSs基因簇的方法替换非核糖体多肽合成酶的结构域，理性的设计出新的环脂肽类抗生素。如：利用组合生物合成技术(combinatorialbiosynthesis)合成CDA衍生物［9，10］。

环脂肽类抗生素的发酵工艺

环脂肽抗生素多为微生物发酵产生的多组分混合物，可以通过在培养基中添加脂肪酸，氨基酸前体提高相应组分的含量或产生新的衍生物。如在培养液中添加Val可以提高对于A21978C2的产量，添加Ile可以提高A21978C1和A21978C3含量，添加Leu(leucine)则可以生成新的衍生物［11］；A54145和CDA的发酵合成也存在类似的现象［12］。因此，利用前体控制发酵工艺(precursor-directedfermentation)可以改变环脂肽类抗生素肽尾上的脂肪酸和特定位置的氨基酸，以提高其目的组分产率或生成新的衍生物。

3达托霉素的药效学研究

目前进入临床研究阶段的环脂肽类抗生素仅有达托霉素，药效学的研究表明，达托霉素的抗菌谱基本涵盖近二十年世界范围内收集的所有革兰阳性病原菌，而且对临床上出现的高致病性耐药菌如：糖肽类敏感金葡菌(GISA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)及耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等有很好的疗效［13］。此外，由于其作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同，也不存在交叉耐药性的问题。

达托霉素的药理研究［14，15］

研究表明，达托霉素的作用靶点不是青霉素结合蛋白，而是通过结合在细菌细胞膜上，干扰细胞的复制，导致细菌迅速死亡。此外，达托霉素的亲脂链可以嵌入细胞质膜，导致钾离子渗出，引起细胞膜的去极化，破坏离子梯度。缺乏合适的离子梯度，细菌胞内的三磷酸腺苷合成受到阻遏，因而细菌的蛋白质、RNA和DNA合成也同时受到抑制。也有报道称，达托霉素可以使细菌的磷壁酸合成受到抑制，直接导致细胞迅速死亡。经达托霉素处理的金葡菌电镜扫描相片显示，达托霉素可以在细胞没有发生自溶的情况下迅速杀死细胞，这样就避免了因细胞磷壁酸、肽聚糖和DNA的释放而引起的炎症反应。

达托霉素的药动学研究［16］

达托霉素获FDA批准按照每日一次4mg/kg的剂量使用，其在体内表现出线性良好的药代动力学曲线，血药浓度-时间曲线严格遵循两室模型的一级消除动力学，最大血药浓度为57μg/ml，曲线下面积为494g×h/ml，消除半衰期为8～9h，表观分布容积为/kg，血清蛋白结合率约92%,抗生素后效应为3～6h。该药主要通过肾脏消除，三分之二的药物以原药形式排泄，没有发现结构性和毒性代谢。此外，达托霉素在体内不能透过血脑屏障。体外研究表明，细胞色素P450酶不参与达托霉素的代谢。达托霉素也不能抑制或诱导P450的诸多同工酶活性，因此达托霉素不存在着可以预见的代谢反应。

达托霉素的适应症与临床研究

达托霉素治疗复杂皮肤感染和结构性皮肤感染被批准的剂量为每日一次4mg/kg，使用%氯化钠溶液静脉注射，疗程约7～14d。达托霉素除了应用于FDA批准的适应症外，对其他耐药性革兰阳性菌引起的感染尚处于临床研究阶段(如所示)。同时，在给药途径上，其口服制剂也在由Cubist公司和Emisphere公司联合研发。

达托霉素的协同用药与不良反应［16，17］

体外研究表明，达托霉素在体外与利福平、氨苄西

林和庆大霉素联用对肠球菌有良好的协同抑菌作用；达托霉素与苯唑西林对耐苯唑西林菌株(如MRSA)有协同作用；对于心内膜炎老鼠模型，达托霉素和利福平对金葡菌有协同抑制作用。目前为止，还没有发现达托霉素与其他抗生素有拮抗作用。

在不同实验动物中，达托霉素可产生肌肉、神经、肾脏和肠胃道的毒性；骨骼肌肉对达托霉素的不良反应最敏感。健康志愿者接受该药多剂静脉给药后可出现一过性肌无力、肌痛及肌酸磷酸激酶(CPK)升高，以上不良反应在中止用药后自行消失或部分逆转。

4结语

现有各类抗生素药物多发现于20世纪40～60年代，它们绝大多数属于微生物产生的抗菌活性物质。人们在此基础上通过结构改造，发展获得了大量新抗生素，如青霉素类、头孢菌素类，大环内酯类和喹诺酮类。这些抗生素按照作用机制可以分为4类，即抑制细菌细胞壁生物合成、抑制细菌蛋白质合成、干扰细菌DNA复制和叶酸辅酶生物合成。以达托霉素为代表的环脂肽类抗生素，其化学结构、作用机制均有别于以上各类抗生素。

作为近四十年开发的仅有两类新结构抗生素之一，2000年Pfizer公司研发的利奈唑烷(linezolid)上市不到一年就出现交叉耐药菌的报道［18］。达托霉素作为应用到临床的首个环脂肽类抗生素，至今尚未有交叉耐药菌的报道，临床耐药菌株的出现几率极低(%)［17］。这在医院院内感染严重、高致病耐药菌肆虐的今天，显得尤为重要，预测2007年其全球的市场份额将达到20亿美元。同时，达托霉素的热销也势必引发医药界对环脂肽类抗生素研发的热情。

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