第八章合子胚培养

第八章合子胚培育

合子胚培育的见解

1.1植物胚胎培育的见解

植物胚胎培育是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培育，使其发育成完满植株的技术。当前，胚胎培育除了应用于育种工作外，还宽泛被用来研究胚胎发生过程中的生理代谢变化以及有关影响胚

发育的内外因素等问题。而且，在离体胚培育成功的基础上，又进行了胚乳、胚珠和子房的培育，特别是未受精胚珠或子房培育，为进行离体授粉(或试管受精)的研究供给了重要的技术条件。试管受精技术使战胜远缘杂交中花粉与柱头之间的不亲和性成为可能。

1.2合子胚培育的见解

合子胚培育是指在无菌条件下分别和培育有性胚，以期获取可育植株的一种技术。1904年，Hannig最早在无菌条件下进行了离体胚培育实验，他当时所培育的是两种十字花科植物—辣根菜和萝卜的成熟胚。在含无机盐和蔗糖的半固体培育基上，Hannig成功将胚培育成可移栽的幼苗。随后，很多研究者从一些植物的成熟种子，特别是从败育致使种子不能够萌生的植物中分别种胚，经过离体培育获取植株。依靠合子胚培育技术，现在已经能够挽救早熟败育的杂志胚了。

胚培育的种类

离体胚培育可分为幼胚（未成熟胚）培育和成熟胚培育。离体培育中，这两类胚的成苗路子和所需营养条件也不太同样。

2.1成熟胚培育

由于成熟胚生长不依靠胚乳的储蓄营养，只需供给合适的生长条

件及打破休眠，它即可在比较简单的培育基上萌生生长，形成幼苗。

所以，培育基只需含无机盐和糖即可。其他，成熟胚培育技术也要求

不严，将受精后的果实或种子(带种皮)用药剂进行表面消毒，剥取种

胚接种于培育基上，在人工控制条件下即可发育成完满植株。

2.2幼胚（未成熟胚）培育

幼胚指的是还没有成熟即发育初期的胚。它较成熟胚难培育，要求的技术和条件也较高。幼胚培育时，可能有三种生长方式：一是连续进行正常的胚胎发育，保持胚性生长，最后形成拥有萌生能力的成熟胚；二是不能够保持胚性生长，快速萌生为幼苗，这类未经达成正常的

胚胎发育过程而形成幼苗的现象称为“早熟萌生”(precociousgermination)。三是形成愈伤组织。由于早熟萌生形成的幼苗经常畸

形瘦小，甚至死亡。所以，进行幼胚培育时，重点是保持胚性生长。为了保证离体幼胚能沿着胚胎发生的路子发育，其对营养的需求较成熟胚复杂。其他，经过培育远缘杂交后的幼胚可获取远缘杂种。

合子胚培育方法

3.1资料的选择与灭菌

由于植物种类及实验目的的不同样，幼胚培育对资料的要求也不同样样。若是是一般的实验或示范，最好是先用一种胚易于剥离的植物如大粒种子的豆科和十字花科植物；如希望培育资料的胚发育时期拥有一致性，应选择开花和结实习惯有规律的植物，如荠菜拥有总状花序，各个胚珠处于不同样的发育时期，一般沿花序轴由上而下，胚龄渐渐增

加。每个蒴果含20～25个胚珠，且基本处于同一发育时期；如希望培育某一发育时期的胚，则须对刚开放的花进行人工授粉，并认识该植物授粉后的天数与胚胎发育的相应关系；如培育远缘杂种胚，则必定在其夭折前进行。

取回大田或温室里授粉受精后的植物子房，用70％的酒精进行几秒表面消毒，再用0.1％氯化汞灭菌10-30min，用无菌水冲刷3～

次，即可用于胚的分别和培育。

3.2胚的分别及培育

3.2.1胚的分别

一般来说，在进行胚的离体培育时，必定把胚从周围的组织中剥

离出来。成熟胚只须剖开种子即可剥离，比较简单。但有些种子种皮

很硬，须先在水中浸泡此后才能剖开。在剥取比较小的胚的时候则须

借助解剖镜，而且在剥离出来后，要立刻转入培育瓶中。

关于幼胚的剥离，是把灭菌后的资料在无菌条件下切开子房壁，

用镊子取出胚珠，剥离珠被，取出完满的幼胚，并置培育基进步行培

养。由于植物的种类及发育时期的不同样，幼胚分其他技术和难度也不

同样(p160～161，荠菜和大麦的幼胚剥离)。

3.2.2胚的培育

关于成熟胚来说，由于其生长不依靠胚乳的储蓄营养，只需供给合适的生长条件及打破休眠，它即可在比较简单的培育基上萌生生

长，形成幼苗。所以，培育基只需含无机盐和糖即可。其他，成熟胚培育技术也要求不严，将受精后的果实或种子(带种皮)用药剂进行表

面消毒，剥取种胚接种于培育基上，在人工控制条件下即可发育成完满植株。

幼胚较成熟胚培育难，要求的技术和条件也较高。胚胎发育过程可分为两个时期：一为异养期(heterotrophyperiod)，即幼胚由胚乳及周围的组织供给养分；二为自养期(autotrophyperiod)，此时

的胚已能在基本的无机盐和蔗糖培育基上生长。胚由异养转人自养是其发育的重点时期，这个时期出现的早晚因物种而异。在这两个时期之内，培育中的胚对外源营养的要求随胚龄的增加而渐渐趋向简单。

在人工培育基上幼龄胚平常很难培育，只管对培育基做了很多改良，胚在发育的极早时期仍发生夭折，幼胚很难培育成功。在这类情况下，利用胚乳看护培育，则可显然提高幼胚的成活率，由于植物正常的生长发育中，胚是由牢牢包围它的胚乳组织供给营养的。如进行大麦未成熟胚离体培育时，若是在其周围培育基上存在来自同一物种的离体胚乳，则对胚的生长有显然促进作用。有时异种胚乳对胚的生长比同种的更加合适，如进行谷类胚乳看护培育时，把大麦的胚移植到小麦胚乳上，其生长优于在大麦胚乳上。在大麦×黑麦的属间杂交中，若把杂种未成熟的胚放在起初培育的大麦胚乳进步行培育，可使30％～40％的杂种未成熟胚发育成苗，而传统的胚培育法只有1％的成功率。

影响胚培育的因素

4.1培育基

4.1.1无机盐

用于胚培育的无机盐配方很多，对其中每种成分的作用并无精准

的谈论。成熟胚培育中，主要采用一些较简单的培育基，如Tukey、

Randolph、White等。幼胚培育的培育基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、

White、Rangaswang、Norstog等。Monnier(1976)研究了几种标准的

无机盐溶液(包括Knop、Miller、MS等培育基)对荠菜胚培育的作用，

发现在必然的培育基上，未成熟胚的生长和存活之间其实不存在有关性

p165，图10.6）。如在MS培育基中，未成熟胚的生长最好，但存活率却低；在Knop培育基中，诚然其毒性小，但胚的生长却较差。

Monnier经过改动MS培育基中每一种盐分的浓度，配制了一种既有

利于生长、也有利于存活的新培育基。在这类培育基上，胚的生长和

存活都很好，与MS培育基对照，这类培育基中K＋和Ca2＋的水平比较

＋高，而NH4的水平则低(p157表10.3)。

另据Umbeck和Norstog(1979)报道，培育基中的NH4＋关于大麦

—未成熟胚的正常生长和分化是必要的。当以N03作为无机氮的独一来

源时，500μm长的大麦胚在培育中只能略有生长，而这主若是由于

细胞伸长造成的。盾片等的分化则需要有＋的4.3～8.6mmo|／LNH4存在。在曼陀罗和紫花曼陀罗中，对未成熟胚的培育来说，NH4＋或是

必要的，或是一种较好的无机氮；另一方面，黄麻的胚则绝对需要硝

态氮。

4.1.2碳水化合物

在离体的成熟胚和未成熟胚培育中，一般都需要有一种合适的碳

源。迄今为止，蔗糖被认为是碳水化合物的最好形式，在胚培育中的

应用最为宽泛。在胚培育基中加入蔗糖不只是作为一种能源，而且是为了保持合适的浸透压，后者关于未成熟胚的培育来说特别重要。最适蔗糖浓度因胚的发育时期而有所不同样。成熟胚在含2％蔗糖的培育基中就能很好生长；幼胚则要求较高水平的糖浓度，若是浓度过低，会惹起幼胚过早萌生。这是由于在自然条件下，原胚就是被一种高渗液体包围着的。适于原胚培育的蔗糖浓度一般为8％～12％。在长久的培育过程中，随着培育时问的增加，必定把胚转移到蔗糖水平渐渐降低的培育基中。

还有见解认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上其实不依靠于浸透压的大小，而主要取决于某些生长调治物质的存在与否。

如高浸透压阻拦离体未成熟胚早熟萌生的作用能够用ABA有效地取代。

4.1.3氨基酸和维生素

在胚培育中加入氨基酸，不论是单调的仍是复合的，都能刺激胚

的生长。加单调氨基酸时，以谷氨酰胺最有效，如500mg／L的谷氨

酰胺可促进多栽种物离体胚的培育，1600mg／L的谷氨酰胺能强烈促进银杏胚形成的幼苗生长。

水解酪蛋白(CH)是一种氨基酸复合物，素来被宽泛用于胚培育。

如水解酪蛋白和酵母提取物对荠菜及棉花心形胚生长有显然的促进

作用，水解酪蛋白是四时橘很小的球形胚(14～28μm×14～28μm)的培育所必要的。

胚对水解酪蛋白的敏感性因物种而异，栽种大麦最适浓度为

500mg／L；毛曼陀罗和曼陀罗的胚在含有400mg／LCH的培育基上长得最好；50mg／LCH能促进紫花曼陀罗胚的生长，但100mg／L时则有损害作用。

常用于胚培育的维生素类有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。

维生素对发育初期的幼胚培育是必要的，而已萌生生长的胚，因其细

胞能合成自己需要的维生素，维生素的加入可能对其形态发生有控制

作用。所以，最好是只有在经过实考证实了它们的必要性此后，再在

培育基中加入维生素。硫胺素对植物胚培育的根伸长有促进作用，烟

酸、泛酸钙和生物素则对茎生长的促进作用更加显然。

4.1.4植物生长调治剂

除了在某些植物中为了打破休眠以外，没有凭证表示离体的成熟或未成熟胚的正常发育需要外源生长调治物质。实质上，生长素关于胚的生长平常表现控制作用。Monnier(1978)建议，在胚培育基中不应加入植物激素，免得惹起构造异样。他认为胚对大部分生长调治物质都是自主的。在这点上最少对GA3来说已在菜豆上获取了清楚的证明，其中胚柄能够知足离体胚对激素的需要。可是，若是为了由胚和胚段引诱愈伤组织，则平常都须在培育基中加入生长素或细胞分裂素，或二者都加。

在大麦未成熟胚(500m长)培育中，若加入ABA，特别是当有NH4+存在的情况下，不单能够控制由GA3和激动素所促成的早熟萌生，而且能使胚序次进行正常的发育。

4.1.5天然有机物

正常植物体上，胚的生长受胚乳滋润，所以，加入一些天然的胚

乳或种子提取物，对离体胚的生长有促进作用。20世纪40年月，Van

Overbeek等使用椰子汁培育曼陀罗的心形胚获取成功后，人们宽泛

地在胚培育中使用椰子汁。使用多种天然提取物(大麦胚乳、麦芽、

马铃薯块、大豆等提取物)进行大麦幼胚(0.5mm胚)培育，只有大麦

胚乳可促进其生长，形成幼苗。在其他植物中也发现近似情况，如玉

米胚乳组织的提取物可促进培育的玉米胚生长。Kent和Brink(1947)

报道，海枣和香蕉的浸提物、小麦面筋水解物、牛奶和番茄汁(TJ)

能够促进大麦未成熟胚的生长和控制它们的早熟萌生。在上述这些物

质中以番茄汁收效最好。其他，还发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有

促进作用，并能减少培育胚的死亡率，控制胚形成愈伤组织。

4.1.6培育基的pH

培育基的pH对胚的培育也有必然的影响。如荠菜胚珠液的pH值约为6.0，而其离体胚在pH值为5.4～7.5的培育基中都能正常生长。对紫花曼陀罗心形初期的胚培育最适pH值在5.0～7.5的范围内。8日龄的水稻胚在pH值5和9时，生长最好。Norstog和Smith(1963)

报道，培育基的pH值关于大麦未成熟胚的器官分化是重点因素，最

适值约为4.9。当pH值在5.2以上时，胚虽能生长，但不发生显然

的分化。

4.2培育条件

4.2.1温度

大部分植物胚培育的温度为25～30℃，但也有些植物需要较低

或较高的温度。如马铃薯胚培育时温度20℃较好，香子兰的胚在32～

34℃下生长最好，柑橘、苹果、梨25～30℃是合适的，棉花胚32℃

生长最好。有些植物，如桃的胚培育则需在变温条件下进行。

4.2.2光照

由于胚在胚珠内的发育是不见光的，所以一般认为在黑暗或弱光下培育幼胚比较合适，光对胚胎发育有略微的控制作用。离体培育条件下进一步发育的幼胚对光的需求，因植物种类而异。棉花幼胚先在黑暗中培育，尔后转入较强光照下培育，子叶的叶绿素生成很慢，但转人弱光下培育，子叶很简单产生叶绿素；荠菜胚培育，每日赏赐12h的光照比全黑暗条件好。

4.3胚柄

胚柄是一个短寿的构造，长在原胚的胚根一端，当胚达到球形期时，胚柄也发育到最大。有关胚柄的构造、细胞学和生理生化的详尽研究表示，胚柄积极参加幼胚的发育过程。一般胚柄较小，很难与胚一同剥离出来，所以培育的胚都不具备完满的胚柄。有研究指出在幼胚培育中，胚柄的存在对幼胚的存活是重点。如红花菜豆较老的胚，不论有无胚柄的存在，均能在培育基中生长；但幼胚培育时，不带胚柄会显然降低形成小植株的频次。由于幼胚培育中，胚柄的存在会显然刺激胚的进一步发育，而且这类作用在胚发育的心形期达到热潮。使用生长调治物质，如5mg／L赤霉素能有效地取代胚柄的作用。如

红花菜豆胚心形期时胚柄中赤霉素的活性比胚自己高30倍，子叶形成后，胚柄开始解体，GA3水平开始下降，但胚中GA3的水平增高。当

没有胚柄存在时，必然浓度范围的KT可促进幼胚的生长，但其作用难与赤霉素对照。

但Monnier(1978)的见解是，无胚柄的极幼龄胚所以难于培育，是由于在除去胚柄时所惹起的损害造成的。在荠菜幼胚培育中，无胚柄的胚在胚柄与胚连结点周边的胚根原地区会出现细胞坏死的现象。

胚培育的应用

5.1经过“胚挽救"获取远缘杂种

合子胚培育的最大用途是借以成立罕有的远缘杂种。在很多种间和属间杂交中，受精作用能正常达成，胚也能进行初期的发育，但由于胚乳发育不正常或杂种胚与胚乳之间生理上的不协调，造成杂种胚初期夭折，即发生所谓“受精后阻拦”，最后不能够形成有萌生力的种子。在这类情况下，经过“胚挽救”即可战胜这类受精后阻拦，产生远缘杂种。“胚挽救”的方式有3种：一是杂种幼胚在人工培育基上培育，二是杂种幼胚的胚乳看护培育，三是杂种幼胚的愈伤组织培育：

5.1.1杂种幼胚在人工培育基上培育

在发生“受精后阻拦”的情况下，若把杂种胚在开始夭折以前剥

离出来，置于一种合适的人工培育基上培育，则杂种胚经常表现出正

常生长的潜力，最后长成杂栽种株。比方，黄香草木犀是一种很重要

的牧草，但其植株中含有大量对牛有害的物质—香豆素。同属的另一

个物种白香草木犀香豆素含量很低，为了把这个有利性状转入到前一

个物种，将这两个物种进行了杂交，结果是，杂种胚虽能生长一段时

间，但由于授粉8～10d后胚珠夭折，未能获取种子。今后经过杂种幼胚培育的方法，终于由这个杂交组合中获取了杂栽种株。采用近似方法，在花百合与王百合之间，鹿子百合与天香百合之间，以及车轴草属的若干物种之间也获取了杂种。

在稻属植物中，很多研究者都想经过种间杂交选育抗病虫害和抗逆的高产水稻品种，但胚的夭折素来是实现这个目标的一个严重障

碍。胚培育正是战胜这个阻拦的有效路子。在若干个平常不能够成功的稻属种间杂交中，人们经过对杂种胚进行培育而获取了正常的杂栽种株。

在番茄中，为了把抗病虫害的特点由野生物种转移到栽种物种，

一个理想的路子是把栽种番茄和野生番茄进行杂交。当把野生番茄用

做母本时，由于受精前阻拦，杂交不能够成功。可是反交时能够受精，

可是由于胚的夭折不能够形成有生活力的种子。而借助于胚培育，在以

栽种番茄做母本的杂交中获取了杂栽种株。

其他，在有些远缘杂交中，如在大麦×黑麦的杂交中，为了能够

获取适于培育的胚，授粉此后必定在穗子上喷洒GA3，NAA和2ip(二

甲基丙烯嘌磷)的混淆液。在未经办理的穗子上，胚在达到适于培育

的大小以前，种子的发育已经停止。

5.1.2杂种幼胚的胚乳看护培育

若是胚的夭折发生在发育的极初期，由于人工培育基很难取代天

然胚乳的作用，采用以上方法挽救杂种仍会碰到很大困难，在这类情

况下，则可试一试胚乳看护培育法。

5.1.3杂种幼胚的愈伤组织培育

在以上两种方法皆难奏效的情况下，则可试一试杂种幼胚愈伤组织培育法，即先把杂种幼胚引诱成愈伤组织，经过或长或短的继代培育此后，再引诱杂种愈伤组织分化植株。这类方法是20世纪80年月发展起来的一种十分有效的方法。比方，在小麦和簇毛麦的属间杂交中，中国农业大学(1991)采用这类方法，由可是2个不足1mm大小的杂种

幼胚，在不到1年的时间内，获取了数以万计的杂栽种株，经过杂种愈伤组织和杂种试管苗的染色体加倍，获取了不计其数的双二倍体种子。

除了以上介绍的例子外，采用未成熟胚愈伤组织培育方法，在大麦×小麦，栽种番茄×智利番茄等远缘杂交中也都获取了成功。

在远缘杂交此后，经过染色体的定向除去而产生单倍体，是胚培育的另一项新用途。如在栽种大麦×球茎大麦的杂交中，受精作用不难达成，但在胚胎发生的最初几次分裂时期，球茎大麦染色体碰到选择性的裁汰，结果形成了单倍体的胚，它们生长相当迟缓，加之受精

后2～5d胚乳渐渐解体，所认为了获取大麦的单倍体植株，必定把胚剥离出来进行培育。

5.2获取单倍体

在远缘杂交此后，经过染色体的定向除去而产生单倍体，是胚培育的另一项新用途（p175）。

5.3打破种子休眠，缩短育种周期

很多植物的种子发育不完满或有控制物存在而影响种胚萌芽。如

一些