论质量源于设计(QbD)在制剂处方筛选中的应用-以长春新碱脂质体为例

PAGEVPAGE1摘要研究背景：长春新碱是一种广谱抗癌药，广泛应用于肿瘤联合化疗，但由于严重的神经毒性和组织刺激性等不良反应，其临床应用受到限制。众所周知，脂质体是一种靶向给药制剂，具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮系统吞噬而活化机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。研究目的：本研究拟将长春新碱开发成长循环脂质体制剂，以减小其严重的毒副反应。本论文主要论述长循环长春新碱脂质处方的开发，着重探讨QbD在制剂处方筛选中的应用。研究方法：根据QbD的理念，首先明确长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况，结合以往脂质体处方开发的经验和风险评估的手段确定药品的关键质量属性。然后以药品的关键质量属性和目标产品质量为出发点，从内相缓冲液的种类、培化磷脂酰乙醇铵（PEG-DSPE）的用量和药物的装载比例等因素进行系统筛选，以找出高包封率和可接受的体外药物释放度的处方。然后将这些长春新碱脂质体和游离药物进行药代动力学、毒性和抗肿瘤效果对比，最终筛选出既有最佳的抗肿瘤效果又表现出最低毒性的处方，同时对该处方进行初步稳定性考察。结果表明筛选出的处方在冷藏条件下稳定，不易渗漏，包封率高，粒径分布均匀，其质量属性符合预先设定的目标。研究结论：本研究应用QbD的方法进行产品开发，对影响产品的关键质量属性进行了科学系统的研究，找出了影响产品质量的与处方和工艺相关的因素，从而制定合理的控制战略，使研发出的产品能够顺利转移到生产部门，最终实现商业化生产。关键词：质量源于设计，QbD；处方筛选；脂质体；关键质量属性；风险评估；稳定性；药物动力学

TheapplicationofQbDinFormulationDevelopmentforVincristineLiposomeInjectionAbstractBackground:Vincristinehasbeenwidelyusedintreatmentofvariouscancers,especiallyincombinedchemotherapy.However,clinicaluseofvincristinemaycausesevereneurotoxicityandtissuesirritation,whichlimitsitsclinicalapplication.Itiswell-knownthatliposomeformulationisatargeteddrugdeliverysystem,whichhasstructuresimilartocells.Therearemanyadvantagestouseliposomeformulationinclinics.Liposomescouldstimulateimmunesystemonceengulfedbyreticuloendothelialsystem(RES).In-vivodistributionofadrugentrappedintoliposomescouldbechanged,leadingtodecreaseoftherapeuticaldosesandthusadverseeffects.ResearchPurposes:formulatingvincristineintolong-circulatingliposomesmaysignificantlyreduceitssevereadverseeffects,sotheclinicaloutcomecouldbefurtherimproved.ThepurposeofthisthesisistodevelopPEGylatedvincristineliposomeformulationsusingcurrentQuality-by-Design(QbD)approach.ResearchMethods:UsingQbDapproachinformulationdevelopment,thequalitytargetproductprofile(QTPP)oflong-circulatingvincristineliposomewasfirstestablishedandcriticalqualityattributes(CQA)wereidentifiedusingpriorexperienceandriskassessmenttool.Then,thetypeofintraliposomaltrappingagents,theamountofPEG-DSPEandthedrug-to-HSPCratio(D/L)wereinvestigatedtoobtainformulationswithhighencapsulationefficiencyandacceptablein-vitrodrugreleaseprofile.Moreover,in-vivoevaluationinanimalswasalsoconducted,includingpharmacokineticstudies,acutetoxicityandantitumorefficacy.Finally，aPEGylatedliposomeformulationwithimprovedtherapeuticindexandreducedtoxicitywasselected.TheselectedliposomevincristineformulationmetthepredefinedQTPPwithgoodphysicalandchemicalstability,higherencapsulationefficiency,lowerleakingrate,andacceptableparticlesizedistribution.ResearchConclusions:ThethesisworkfollowedtheprincipleofQbDtosystemicallyandscientificallyevaluatethefactorsthathaveimpactonproductqualityattributesandidentifycriticalqualityattributes.Thus,sourceofvariablesinformulationandprocesscanbeunderstoodandproperlycontrolled.Thevincristineliposomeformulationdevelopedfromthisstudyshouldbeabletosuccessfullytransfertoproductionsiteinnextsteptoachievefinalcommercialproduction.Keywords:Qualitybydesign,QbD,formulationscreen,liposome,criticalqualityattributes,riskassessment,stability,pharmacokinetics

目录第1章 前言 1第2章 长春新碱市售制剂分析 32.1长春新碱理化性质 32.2长春新碱的市售制剂 32.3长春新碱的临床应用 32.4长春新碱的药代动力学 3第3章 长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况及关键质量属性 53.1长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况 53.2长循环长春新碱脂质体的关键质量属性 63.2.1pH 63.2.2粒径 63.2.3包封率和体外释放率 73.2.4降解产物 73.2.5残留溶剂 73.2.6无菌和细菌内毒素 7第4章 处方筛选 104.1处方变量的风险评估 104.2内相缓冲液的影响 124.2.1脂质体的制备方学 124.2.2初步分析方法学 134.2.3硫酸铵梯度法[1] 144.2.4磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺梯度法[5] 144.2.5试验结果 154.3培化磷脂酰乙醇铵（PEG-DSPE）密度的影响 164.4药物-类脂比（D/L）的影响 194.5不同脂质体处方对药代动力学的影响 204.5.1方案设计 204.5.2动物及饲养 204.5.3供试品和对照品 214.5.4样品采集及处理 214.5.5试验结果 214.6不同脂质体处方对体内毒性的影响 224.6.1方案设计 224.6.2动物及饲养 224.6.3供试品和对照品 234.6.4试验内容 234.6.5试验结果 244.7不同脂质体处方的抗肿瘤活性比较 244.7.1方案设计 254.7.2供试品和对照品 254.7.3动物及饲养 264.7.4试验内容 264.7.5试验结果 274.8脂质体处方的初步稳定性考察 284.8.1稳定性研究 284.8.2试验结果 294.9处方因素的更新风险评估 30第5章 结论 32参考文献 34致谢 35PAGE35前言脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。早在1965年，英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了这样的分子结构，把它称作为脂质体，并首次展示了脂质体的图像，球状的、自我封闭的、分散在水中并且包封一部分水性介质的脂质粒子[1]。之后脂质体进入快速发展期。近年来，随着生物技术的不断发展，脂质体的制备工艺逐步完善，加之脂质体适合于生物体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是脂质体作为药物载体，具有靶向性，从而能够减少药物剂量，降低毒性，减少副作用等，因此脂质体靶向给药系统已愈来愈受到重视并得到广泛应用。癌症是人类的大敌，在攻克癌症堡垒中，目前化疗还是主要的手段，而提高化疗效果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。脂质体剂型可以在某种程度上提高化疗药物的靶向性，并大幅度地降低化疗药物的毒副作用，从几种途径上提高化疗药物的治疗指数。与目前其他的抗癌药物剂型相比较，药物脂质体具有独特的优点，早已为国内外专家所瞩目。长春新碱是从夹竹桃科植物长春花中提取的一种生物碱，有广泛的临床应用（尤其是治疗儿童和成人的恶性肿瘤），被认为是一种重要的抗肿瘤药物。长春新碱对细胞有多种影响，但其作用机理仍在进一步研究中。一般认为的作用机理是长春新碱抑制了微管蛋白的聚合，从而影响纺锤体微管的形成，使细胞分裂阻止在中期，从而抑制了肿瘤的生长。随着长春新碱在临床上的广泛应用，其不良反应报道也日趋增多，尤其是与剂量相关的神经系统毒性，主要引起外周神经症状，如手指、神经毒性等，与累积量有关。其他还有足趾麻木、腱反射迟钝或消失，外周神经炎。此外也有腹痛、便秘，麻痹性肠梗阻的报道。运动神经、感觉神经和脑神经也可受到破环，并产生相应症状。神经毒性常发生于40岁以上者，儿童的耐受性好于成人，恶性淋巴瘤病人出现神经毒性的倾向高于其他肿瘤病人。骨髓抑制和消化道反应较轻，有局部组织刺激作用，药液不能外漏，否则可引起局部坏死，可见脱发，偶见血压的改变。其严重的神经毒性和组织刺激性等不良反应，已经限制了其临床应用。而脂质体作为抗癌药物载体具有能增加与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加药物被癌细胞的摄取量，降低用药剂量，提高疗效，降低毒副作用的特点。因此本研究拟将长春新碱开发成长循环脂质体制剂。本论文采用QbD理念来研发疗效高、毒性低的长循环长春新碱脂质体。首先分析研究长春新碱的市售制剂的临床用量、理化性质、药代动力学等参数。进而确定长循环脂质体制剂的目标产品质量概况（QTPP）以及关键质量属性（CQA）。然后以此为目标，从辅料的种类、用量、和药物的装载比例等因素进行系统研究，并和市售制剂进行对比，最终筛选出既有好的抗肿瘤效果，又有最低毒性的处方。本论文应用实例阐明了QbD的理念在制剂处方开发中的应用。应用QbD的理念进行产品开发，可以使研发人员可从临床患者角度出发来确定产品的目标质量特征，建立药品的关键质量属性，以保证药品的质量能满足患者需要。在产品的研发过程中，强调对影响产品质量的处方和工艺过程中的变异因素进行科学系统的研究，从而理解哪些因素对关键质量属性有影响，并对此加以合理地控制，以确保上市产品生产的长期可靠性和一致性。

长春新碱市售制剂分析2.1长春新碱理化性质游离长春新碱为片状结晶，极不稳定，因此常用其硫酸盐。其盐为白色或类白色结晶粉末，无臭，有吸湿性，遇光或热易变黄。熔点为218-220◦C。在水中易溶，在甲醇或三氯甲烷中能溶解，在乙醇中微溶。硫酸长春新碱为亲水性药物，因此拟开发的长春新碱脂质体可以采用主动载药方式，即先形成空白脂质体，再借助特定的梯度（如pH梯度或硫酸铵梯度）来实现药物的装载。2.2长春新碱的市售制剂目前临床上使用的均为硫酸长春新碱普通注射剂型，即注射用硫酸长春新碱，规格均为1mg。国内有两家单位申报长春新碱的特殊制剂，分别为上海复旦张江生物医药股份有限公司申报的注射用硫酸长春新碱脂质体浓溶液和南京思科药业有限公司申报的注射用硫酸长春新碱脂质体。临床上应用的均为长春新碱的普通注射剂，因此拟开发的长春新碱脂质体的质量特征和市售制剂对比时，直接采用原料药配制的水溶液来代替。2.3长春新碱的临床应用静脉给药，成人剂量1～2mg(或1.4mg/m2）最大不大于2mg，年龄大于65岁者，最大每次1mg。儿童75μg／kg或2.0mg/m2,每周1次静脉注射或冲入。联合化疗是连续用药2周为一周期。市售制剂规格为1mg，临床上最大使用剂量为2mg，鉴于计划开发的长循环长春新碱脂质体有可能降低毒副作用，可以增加给药剂量，故将产品规格升高到临床的最大使用剂量2mg。2.4长春新碱的药代动力学静脉注射长春新碱后，药物迅速分布于各组织，神经细胞内浓度较高，很少透过血脑屏障，脑脊液浓度是血浆浓度的1/30～1/20。蛋白结合率75%。在成人，T1/2α小于5分钟，T1/2β为50～155分钟，末梢消除相T1/2γ长达85小时。长春新碱在肝内代谢，在胆汁中浓度最高，主要随胆汁排出，粪便排泄70%，尿中排泄5%～16%。为了提高长春新碱在体内的循环时间，计划将长春新碱开发成长循环脂质体，即隐形脂质体。普通脂质体静脉注射后，迅速从血液循环中清除，因此脂质体可能还没有到达靶区，就已经被机体清除掉而无法发挥其治疗作用。而隐形脂质体能够阻止巨噬细胞对脂质体的识别和摄取，从而延长脂质体在血中的循环时间，增加药物与肿瘤细胞的作用时间，并且更利于脂质体借助实体瘤的高通透性和滞留（EPR）效应富集到肿瘤组织中，以此提高对肿瘤细胞的杀伤力，增强药物疗效。隐形脂质体主要是由携带亲水性长链的脂质插入脂质体膜上制备得到的，它能在血液循环中长时间保留，作用机制主要是亲水性长链在脂质体表面形成了亲水性保护层，阻止了调理素的吸附，因而减少了网状内皮系统（RES）的摄取。常用于长循环脂质体的脂质成分为培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE），目前这种材料已经商业化，已上市的盐酸多柔比星脂质体制剂中也使用了该种长循环材料。因此，开发体内长循环脂质体是切实可行的。

长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况及关键质量属性3.1长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况目标产品的质量概况是药品质量属性的前瞻性总结，具备这些质量属性，才能确保产品质量，并最终保证药品的安全性和有效性。目标产品的质量概况是QbD方法的一个基本要素，构成了该产品的设计基础。因此，从长春新碱的市售产品的属性出发，考虑到临床患者的需求，首先确定计划开发的长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况。表3-1目标产品质量概况（QTPP）QTPP要素目标剂型注射剂药代动力学延长在体内的循环时间，其半衰期大于游离药稳定性2-8℃稳定，贮存期间，药物不从脂质体囊泡中渗漏疗效不低于游离药毒性低于游离药药品质量属性性状符合质量标准鉴别pH粒径包封率体外释放率含量有关物质残留溶剂无菌细菌内毒素3.2长循环长春新碱脂质体的关键质量属性关键质量属性（CQA）是产品的某种物理、化学、生物学或微生物学特性或特点，只有当这一性质或特点在一个适当的限度、范围或分布内，才能保证所期望的产品质量，保证产品安全有效[2]。因此需在QTPP中确认关键质量属性，作为产品控制战略的关键部分。3.2.1pH在脂质体制备过程中，无论是天然来源的磷脂，还是人工合成的饱和磷脂，都有可能发生水解。磷脂水解掉一条酰基链后，就会形成溶血磷脂。溶血磷脂作为表面活性分子，如果在脂质体中的含量超过一定的比例，就会导致脂质体解体。同时溶血磷脂本身由于可以破坏磷脂膜，对机体的细胞可能也有毒害作用。因此要严格的监控磷脂水解的程度。通常，磷脂分子在pH6.5左右最为稳定[1]，如果pH偏酸或者偏碱，或者温度升高，磷脂的水解常数都会增加。因此为了保证产品的质量，对产品的pH需要进行严格控制。3.2.2粒径实体瘤的高通透性和滞留效应（enhancedpermeabilityandretentioneffect，EPR）是脂质体从血液向肿瘤中转运并在肿瘤组织中滞留的原因。正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子和脂质颗粒不易透过血管壁，而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应，简称EPR效应。EPR效应促进了大分子类物质在肿瘤组织的选择性分布，可以增加药效并减少系统副作用。文献报道[3]，当脂质体粒径在100nm左右时，血循环时间最长。可能由于粒径超过100nm的脂质体进入体内后迅速被单核吞噬细胞系统（MPS）清除，其半衰期很短，而粒径小于100nm的脂质体能穿过窦状型毛细血管离开循环系统到相关组织(肝、脾、骨髓和实质性肿瘤等)。脂质体粒度的控制是一个非常重要的问题。最终产品的粒度会显著影响其体内行为，进而影响被包封的药物的治疗效果和毒性。经过合理设计的脂质体由于EPR效应能够在肿瘤组织中蓄积，减少药物在正常组织的分布，从而提高了药物的安全性和治疗的有效性。因此本研究中将粒径控制在100nm左右。为了使最终产品的粒度在需要的范围内，必须使用合适的制备工艺和制备设备。不同的制备工艺得到的脂质体的粒度是不同的。本研究选用同一制备工艺，考察处方中各种变量的影响。因此仅需对产品的粒度进行控制，使其在合适的范围即可。3.2.3包封率和体外释放率包封率(entrapmentefficiency，EE)，又称为包裹率、包封效率等，是指包封在脂质体内的药物量占投料量的百分比。包封率和很多因素相关，如类脂的种类及用量、药物的性质、药物-类脂比等，是脂质体制剂的一项重要质量指标，直接影响脂质体在机体组织的行为。一个良好的脂质体处方应该具备较高的包封率，且在贮存期内稳定，因此将其作为关键质量属性，进行重点评价。一个良好的抗肿瘤脂质体处方应该具备经静脉给药后，在血液循环中药物不释放或较少释放；当到达肿瘤区后，药物能有效的释放的特点，这样才能降低药物毒性，更好的发挥治疗作用。体内的释放情况往往用体外方法代替。因体外释放试验是在体温下，等渗的缓冲液中进行的，这些触发药物释放的因素和血浆中是类似的，例如稀释效应，逆转的pH梯度，可以很好的模拟体内释放情况。因此体外释放度也是脂质体制剂的一项重要质量指标，将其作为关键质量属性，进行重点评价。3.2.4降解产物降解产物是指新药制剂在生产和贮藏过程中，因光照、温度、pH、水或与赋形剂和/或包装系统互相反应而导致原料药发生化学变化而产生的杂质[4]。虽然长春新碱原料对光、热敏感，但考虑到制成脂质体后，可以将原料药包裹到脂质双层的囊泡中，因此在处方筛选阶段不作为关键质量属性进行考察，仅在初步的稳定性研究中作为考察指标。3.2.5残留溶剂制备脂质体的过程中，几乎不可避免的要使用有机溶剂。除了乙醇以外，几乎所有的溶剂都是对机体有害的溶剂；因此制备的产品，对有机溶剂的残留量应该予以控制。不同的制备工艺，使用的有机溶剂不同，应采取不同的控制手段。但在本研究中，采取同样的制备工艺，同时制备规模较小，为实验室制备，可以很有效的除去有机溶剂，因此在本研究中，对残留溶剂暂不进行考察。3.2.6无菌和细菌内毒素无菌和细菌内毒素是无菌制剂的关键质量属性，主要与制备工艺和生产系统相关，本研究为实验室规模，不具备无菌生产所需要洁净环境，因此对此不进行考察。药品的质量属性的系统分析结果，如下表所示：表3-2药品质量属性药品质量属性目标是否是CQA依据性状乳白色的混悬液否产品的性状不直接与安全性和有效性相关联。因此不是关键质量属性。鉴别确定为原料药长春新碱是虽然对于安全性和有效性来说，鉴别项是关键指标，但这个关键质量属性可通过质量管理体系得到有效控制，并会在药品放行是进行检测。处方和工艺变量不会影响鉴别项，因此在处方筛选过程中不会对该关键质量属性进行讨论。pH6.0-7.0是pH的变化会影响磷脂的稳定性，从而影响产品的安全性，但在处方筛选过程中，采用相同pH条件制备，因此不再对该关键质量属性进行讨论。粒径75nm-150nm是粒径的变化会影响安全性和有效性，处方的变化可能会影响药品的粒径，因此，在处方筛选的过程中，需要对该关键质量属性进行控制，将其控制在合适的范围内。包封率不小于90%是包封率的变化会影响安全性和有效性，处方和工艺变量均会对包封率造成影响，因此，对包封率的测评贯穿于产品和工艺开发的整个过程。体外释放度在释放介质中能缓慢释放是药物释放的快慢直接影响产品的安全性和有效性，且随着处方的变化而变化，因此，在处方筛选的过程中，需要对该关键质量属性进行评价。含量标示含量的90%-110%是含量的变化会影响安全性和有效性，工艺变量可能影响药品的含量，但在处方筛选过程，影响较小，因此在处方筛选过程中，不进行重点考察，仅在稳定性研究中考察。降解产物总杂质小于1%是降解产物会影响安全性，必须根据药典要求对其进行控制以减少对患者的影响。因在制备过程中，原料较稳定，因此在处方筛选过程中，不进行重点考察，仅在稳定性研究中考察。残留溶剂符合药典规定是虽然残留溶剂会影响安全性，但处方和工艺变量不太可能影响该关键质量属性，因此不再讨论。无菌符合药典规定是不符合无菌将会影响患者的安全。然而，在本研究中，仅限于小试处方筛选阶段，暂不考虑无菌方面的影响，因此在处方筛选的过程中，不再对该关键质量属性进行讨论。细菌内毒素符合药典规定是不符合细菌内毒素同样将会影响患者的安全。然而，在本研究中，仅限于小试处方筛选阶段，暂不考虑细菌内毒素方面的影响，因此在处方筛选的过程中，不再对该关键质量属性进行讨论。

处方筛选4.1处方变量的风险评估本公司已经开发出盐酸多柔比星脂质体注射液和盐酸米托蒽醌脂质体注射液，其中盐酸多柔比星脂质体注射液已经取得生产批件，盐酸米托蒽醌脂质体注射液取得临床批件，正在进行Ⅰ期临床试验。两种产品和普通剂型相比较，均显著降低了药物毒性，明显提高了治疗安全指数。本公司在脂质体的处方研究中积累了一定的经验，根据以往的研究经验，首先对拟开发的长循环长春新碱脂质体的处方变量进行了初始风险评估，风险评估结果见表4-1,4-2。表4-1处方变量的初始风险评估药品CQA处方变量内相缓冲液种类培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）用量药物-类脂比率pH低低低粒径低低低包封率高高中体外释放度高高中含量低低低降解产物低低低表4-2处方变量初始风险评估依据处方变量药品CQAs依据内相缓冲液种类pH产品pH值与外相缓冲液的初始pH及缓冲能力相关，所以风险低。粒径内相缓冲液种类对脂质体形成初期的粒径大小有一定影响，但在整粒过程中通过调整设备参数可以达到预期的目标值，所以风险低。包封率在长春新碱的装载过程中，不同的内相溶液提供的pH梯度能力不同，与药物形成复合物的稳定性也不同，从而使药物装载效率差别较大，因此高度风险。体外释放度长春新碱和不同缓冲液的阴离子形成的复合物的解离行为不同，从而影响药物从脂质体内释放的速率，因此高度风险。含量产品初始含量与载药时药物加入量和总体积相关，也会受到除菌过滤膜的影响，存储期含量与药物降解相关，所以风险低。降解产物药物降解与其存在处方的pH、氧化性、辅料相互作用等相关，主动载药脂质体内部pH为酸性是弱碱性药物相对稳定的条件，且所选缓冲液的阴离子均能与药物形成复合物从而进一步增加其稳定性，因此风险低。培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）用量pH产品pH值与外相缓冲液的初始pH及缓冲能力相关，所以风险低。粒径PEG的用量对脂质体形成初期的粒径大小有一定的影响，但在整粒过程中通过调整设备参数可以到达预期的目标值，所以风险低。包封率PEG磷脂为荷负电的磷脂，其分布在脂质体双分子层中，与阳离子药物会产生一定的作用力从而影响药物装载，长春新碱为阳离子药物因此其载药过程可能会受到PEG磷脂的影响，因此高度风险。体外释放度PEG磷脂所荷负电对阳离子药物装载会有影响，同理会对药物的释放会有影响，因此高度风险。含量产品初始含量与载药时药物加入量和总体积相关，也会受到除菌过滤膜的影响，存储期含量与药物降解相关，所以风险低。降解产物药物降解与其存在处方的pH、氧化性、辅料相互作用等相关，PEG磷脂所荷负电与荷正电的药物会产生一定作用力，但是不可能影响药物所处环境的pH、氧化性等，单纯的电荷吸引对药物降解影响也较低，因此风险低。药物-类脂比率pH产品pH值与外相缓冲液的初始pH及缓冲能力相关，所以风险低。粒径药物装载是在制备成合适粒径的脂质体之后，因此药物装载量基本不会影响粒径的变化，从而风险低。包封率一定尺度的脂质体能够装载的药物是有限的，因此随着药物-类脂比的增加，药物的包封率会在某一临界值后快速降低，因此该风险适中。体外释放度药物在脂质体内部的量越多其释放会越慢，这是由于药物的阴离子复合物的溶解和解离速度随浓度增加而降低，但是影响其解离速度最主要的是复合物的性质，而浓度只是对药物释放有一定的影响，因此该风险适中。含量产品初始含量与载药时药物加入量和总体积相关，也会受到除菌过滤膜的影响，存储期含量与药物降解相关，所以风险低。降解产物药物降解与其存在处方的pH、氧化性、辅料相互作用等相关，药物与类脂比率不会影响药物所处环境的pH、氧化性，而类脂与弱碱性药物作用较弱，，且类脂与内水相形成复合物的药物产生相互作用的机会很少，因此风险低。根据对处方变量的风险评估结果，分别从体内和体外两个方面进行处方筛选。在体外通过对内相缓冲液、培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）和药物-类脂比例进行考察，初步确定脂质体处方。然后将不同的脂质体处方通过体内的药代动力学、毒性和抗肿瘤活性的评价，最终确定毒性降低疗效增强的脂质体处方。4.2内相缓冲液的影响硫酸长春新碱为亲水性药物，宜采用主动载药的制备方式，即先形成空白脂质体，再借助特定的梯度来实现药物的装载，常用的主动载药技术为pH值梯度法和硫酸铵梯度法。使用主动载药技术，对药物的性质要求比较严格，能和脂质体的内相缓冲液可以生成较稳定的复合物或者沉淀。只有药物可以和内相缓冲液生成较稳定的复合物或沉淀，才有可能保证药物在贮存期维持其包封效率和载药量，并且给药后，不会由于体液的稀释效应导致药物的大量渗漏。但是这种复合物或沉淀作用又不宜太强，否则有可能药物在病变部位不释放，导致药物的疗效下降。因此内相缓冲液的筛选尤为重要。4.2.1脂质体的制备方学简要地说，氢化大豆卵磷脂（HSPC）、胆固醇（Chol）和培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）的混合物溶解在氯仿中，然后在氮气下干燥成一层磷脂膜，接着在真空条件下除去残留的溶媒。在所有的实例中，HSPC和chol的摩尔比设定为3:2，PEG-DSPE和HSPC的摩尔比根据需要进行调整，比例是0.5%、2.9%和8.3%。干燥的磷脂膜随后用内相缓冲液水化。水化过程在60℃孵育1小时。水化后的溶液在60℃下，通过0.1μm的聚碳酸酯膜挤出8遍，所用挤出仪为Avestin。该过程形成了粒径100nm的均一的粒子囊泡。该囊泡的平均粒径通过ZetasizerNanoZS（马尔文仪器）进行检测。待粒径合格后，再使用SephadexG-75凝胶柱，和脂质体的外相缓冲液进行置换，从而产生跨膜的离子梯度。在实验中使用的外相缓冲液是pH6.5的300mM蔗糖和20mM组氨酸溶液，通过缓冲液的置换，空白脂质体具有了跨膜的离子梯度，然后和长春新碱以设定的质量比进行混合。这混合溶液在60℃孵育设定时间，从而完成药物的装载。4.2.2初步分析方法学包封率：采用凝胶过滤法分离脂质体和游离药物测定包封率，本实验采用葡聚糖凝胶SephadexG-75对游离药物和脂质体进行分离。具体操作如下：用0.9%氯化钠溶液平衡SephadexG-75层析柱3倍柱体积以上，然后取100μl的样品，加入层析柱上端，待药液完全进入胶内后，用0.9%氯化钠溶液洗脱，流速控制在1.0ml/min左右，采用中压层析系统在线监测洗脱情况。根据洗脱曲线，可以很好的分离脂质体部分和游离药物部分。洗脱曲线如下图所示：图4-1洗脱曲线A：脂质体；B：游离药包封率体外释放度：在体内，脂质体的释放由粒径、双分子膜组成及内水相的组成决定；在体外，脂质体的释放受温度、介质中铵浓度、pH值等诸多因素影响。在脂质体体外释放试验中，通常采用磷酸盐缓冲液或生理盐水为释放介质。但是在体内能够促进药物释的一个主要因素是铵离子浓度，为了更准确的模拟体内环境，在本研究中选择pH6.5的葡萄糖组氨酸等渗溶液加入5mM的氯化铵作为释放介质。精密吸取2ml稀释后的长春新碱脂质体注射液，加到经预处理过的透析袋中，将袋口扎紧，固定于桨上并置于装有400ml释放介质的溶出杯中，37℃75rpm恒速搅拌，定时吸取0.1ml脂质体溶液，加入甲醇0.4ml溶解后进行液相测定。含量：取长春新碱脂质体1ml，置于10ml容量瓶中，用冷甲醇溶液定容至刻度。取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。使用外标法计算含量。液相检测：使用Waters液相进行色谱分析，用Zorbax的C18色谱柱，150*4mm2，5μm。洗脱流动相为甲醇/80mM醋酸铵溶液，用盐酸调pH至3.0，体积比为52:48，流速为1ml/min，检测波长297nm。4.2.3硫酸铵梯度法[1]硫酸铵梯度法在20世纪90年代初期由以色列学者发明。该方法的制备过程和传统的pH值梯度犯有相似之处。首先使用硫酸铵缓冲液制备空白脂质体，之后采用交叉流透析等手段除去脂质体外相的硫酸铵。硫酸铵梯度法之所以能够实现药物的装载，可能和游离的氨跨膜扩散，造成磷脂膜内外的pH值得差异有关。硫酸铵梯度法的优势在于制备空白脂质体的过程中，接近中性的硫酸铵水溶液不会引起过多的磷脂分子水解。因为毕竟如果使用饱和磷脂制备脂质体，需要在较高的温度下完成。使用传统的pH值梯度法，可能使得磷脂更容易发生水解。在本研究中，硫酸铵内相溶液溶度为250mM。4.2.4磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺梯度法[5]使用磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为内相制备脂质体的机制基础和传统的硫酸铵梯度方法机制类似。简要地说，当通过缓冲液置换产生磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺的跨膜梯度时，三乙胺（TEA）由于浓度梯度会穿过磷脂膜。TEA的跨膜运动会引起脂质体内部介质酸化，从而产生pH梯度，长春新碱就能主动积累到囊泡中。在本研究，磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相铵离子浓度为500mM。4.2.5试验结果采用同样的处方，两种不同内相缓冲液，分别制备长春新碱脂质体，将粒径控制到同样范围内，分别考察包封率和体外释放度。包封率结果如下表所示：表4-3不同内相缓冲液对粒径和包封率的影响处方内相缓冲液PEG密度（mol%）药物-类脂比粒径（nm）包封率（%）pLV-s-2.9-2硫酸铵2.92:1096.9±0.0691.6pLV-c-2.9-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺2.92:1096.2±0.0598.9pLV-s-2.9-2硫酸铵2.92:1097.4±0.0690.9pLV-c-2.9-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺2.92:1096.9±0.0599.1图4-2不同内相缓冲液对体外释放度的影响结论：从上表检测结果来看，两种内相缓冲液制备的脂质体，虽然包封率均在预期的目标值范围内（不小于90%），但磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相制备的脂质体包封效率较高，大于95%，和硫酸铵内相相比，具有明显优势；在传统的主动载药技术中，药物通过与内水相阴离子（如硫酸根）结合形成沉淀，获得较高的包封率。而长春新碱与脂质体内水相硫酸根不能形成沉淀，因而在内水相中的滞留能力差，影响药物的装载，从而包封率较低；长春新碱与脂质体内水相磺丁基醚-β-环糊精可能形成复杂的络合物。在本研究中所使用的磺丁基醚-β-环糊精的平均取代度大约为7，也就是一个环糊精分子中含有的21个羟基中有7个被磺丁基所取代。由于磺酸具有较低的pKa，在脂质体内部（pH约为5-6）磺丁基醚-β-环糊精带有多重负电。长春新碱的pKa值为5.0和7.4[5]，在囊泡内部，几乎所有的长春新碱分子以带电的形式存在（携带至少一个正电荷），所以每个磺丁基醚-β-环糊精分子通过静电作用能够结合多个长春新碱分子，形成较稳定的络合物，从而获得较高的包封率。相反，一个硫酸根仅能结合两个长春新碱分子，并且不能形成像磺丁基醚-β-环糊精-长春新碱络合物这种物理状态。这种复杂的络合物形式可能和长春新碱从磺丁基醚-β-环糊精囊泡中缓慢释放相关。从体外释放的结果可以看出，磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相制备的脂质体缓慢释放，而硫酸铵内相脂质体释放较迅速，在4小时内已经释放93%。一个良好的抗肿瘤脂质体处方应该具备经静脉给药后，在血液循环中药物不释放或较少释放；当到达肿瘤区后，药物能有效的释放的特点。从体外的释放数据来看，硫酸铵内相的脂质体释放较快，推测其在体内可能尚未到达肿瘤区，在血液循环过程中就已经有效释放，从而影响治疗效果。因此从体外释放的角度来看，磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相缓冲液较理想。4.3培化磷脂酰乙醇铵（PEG-DSPE）密度的影响使用PEG化脂可以增强脂质体膜的亲水性，减少血浆蛋白与脂质体膜的相互作用，阻止了脂质体的凝集和融合，避免了网状内皮系统细胞对脂质体的吸收，从而延长了脂质体的体内循环时间。循环时间延长的多少与PEG分子量大小和加入量有关。文献报道，使用PEG化脂（PEG-DSPE）修饰脂质体时，PEG分子会在脂质体表面形成不同的构象，至于形成哪种构象，与PEG分子量大小和加入量有关[6]。对于PEG-DSPE而言，当PEG-DSPE与HSPC的摩尔百分比大于4%时，会在脂质体表面形成致密的刷状构象，当小于1%时，会形成相互独立的蘑菇状构象，在1-4%之间时，会形成较密集的蘑菇状构象[7][8]。由于PEG-DSPE荷负电，从而脂质体表面荷负电。而脂质体表面电性对其包封效率、稳定性、靶器官分布及对靶细胞作用影响较大。在此，仅就PEG密度对包封率的影响进行初步探讨。下面以磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为例，来说明PEG密度对装载效率的影响。图4-3PEG密度对装载效率的影响如图4-3（b）所示，在高PEG密度时，在脂双层上形成了完全的电子屏障。所以质子化的TEA由于强大的静电相互作用能够吸附到膜上，导致解离平衡移动从而产生更多的质子化的TEA。所以游离的TEA，即跨膜穿过的TEA量减少，这就意味着不能形成有效的pH梯度。如果产生的pH梯度不足以介导药物装载，包封率会急剧降低。同样长春新碱也会结合到脂质体表面的PEG上，所以导致药物的包封率降低。相反，如果PEG密度较低时（如表a所示），静电的相互作用较弱，因此不会对药物的装载产生影响。为了研究不同PEG-DSPE密度对装载长春新碱效率的影响，采用3个不同浓度，分别为0.5%、2.9%和8.3%，分别代表不同构象。采用第一节中脂质体的制备方法分别制备不同PEG密度的长春新碱脂质体，考察对包封效率的影响。结果如下所示：表4-4不同PEG密度对粒径和包封率的影响处方内相缓冲液PEG密度（mol%）药物-类脂比粒径（nm）包封率（%）pLV-c-0.5-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺0.52:1098.9±0.0598.6pLV-c-2.9-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺2.92:1099.3±0.0598.5pLV-c-8.3-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺8.32:1098.3±0.0585.9pLV-s-0.5-2硫酸铵0.52:1098.5±0.0593.3pLV-s-2.9-2硫酸铵2.92:1098.7±0.0691.6pLV-s-8.3-2硫酸铵8.32:1099.2±0.0570.6结论：相对于磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相的脂质体来说，不同的PEG-DSPE密度对长春新碱的装载效率影响不同，在高PEG密度时（8.3%），对包封率的影响较大，产生的pH梯度不足以介导药物装载，从而导致包封率较低；而在低PEG密度时，由于静电相互作用较弱，跨膜穿过的TEA较多，能形成有效的pH梯度，产生的pH梯度足以介导药物装载，所以包封效率较高，且PEG密度为0.5%或2.9%时，包封效率差别不大。硫酸铵内相的脂质体也得到相同的结论。从本次试验数据来看，再次证明了磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相优于硫酸铵内相。从上述试验结果，初步确定内相缓冲液为磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺，PEG-DSPE密度为0.5%或2.9%。4.4药物-类脂比（D/L）的影响载药量的大小直接影响到药物的临床应用剂量，载药量愈大，愈易满足临床需要。此外，较高的载药量也会影响脂质体的稳定性，因此本研究目标筛选较低的载药量，即每10mg氢磷脂对应1、2、3mg长春新碱。本次试验采用磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为内相缓冲液，PEG-DSPE密度分别为0.5%、2.9%，药物-类脂比为1:10、2:10、3:10。采用第一节中脂质体的制备方法分别制备不同药脂比的长春新碱脂质体，考察不同药脂比对包封效率和体外释放度的影响。表4-5不同药物-类脂比对粒径和包封率的影响处方内相缓冲液PEG密度（mol%）药物-类脂比粒径（nm）包封率（%）pLV-c-0.5-1磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺0.51:10101.9±0.0499.6pLV-c-0.5-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺0.52:10101.3±0.0298.2pLV-c-0.5-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺0.53:10104.3±0.0591.6pLV-c-2.9-1磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺2.91:10102.3±0.0698.9pLV-c-2.9-2磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺292:10101.7±0.0698.1pLV-c-2.9-3磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺2.93:10103.6±0.0592.0从上述数据的结果来看，随着药脂比的增加，药物的包封率下降。虽然包封率均在预期的目标值范围内（不小于90%），但因长春新碱的临床用量不大，在满足临床需求的情况下，应选择高包封率的产品，因此药物-类脂比选择1:10或2:10（两者包封效率基本无影响）。仅考察药物-类脂比为1:10和2:10的体外释放度，其结果如下图所示：图4-4不同药物-类脂比对体外释放度的影响从图中可以看出，在相同PEG密度的情况下，药脂比高的样品释放慢；相同药脂比的情况下，高PEG密度样品释放稍快。从药物释放的角度考虑，应该选择低PEG密度，高药脂比的处方。4.5不同脂质体处方对药代动力学的影响为了考察长春新碱制备成脂质体后，是否能达到预期目标——延长在体内的循环时间，其半衰期大于游离药，我们进行了相关的药代动力学研究，比较长春新碱脂质体和长春新碱游离药在大鼠体内的循环时间，并为处方筛选提供初步的体内药代动力学依据。4.5.1方案设计由于文献显示长春新碱的体内药动学无性别差异，因此本实验选取Wistar雄性大鼠，随机分成3组，分为长春新碱脂质体A和B组，以及长春新碱游离药组，每组6只。给药剂量均为1mg/kg，尾静脉单次推注，给药完毕后，将鼠放回鼠笼饲养，并在规定的各时间点采集血样，进行血药浓度测定。4.5.2动物及饲养Wistar雄性大鼠9只，体重180～220g；由河北省实验动物中心提供。动物饲养于清洁级环境，动物自由摄食、饮水，室温20～24℃，湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间12h/12h，实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2006-0046。所有实验动物饲料及垫料均由河北省实验动物中心提供。4.5.3供试品和对照品供试品：长春新碱脂质体脂质体处方ABDSPE-PEG0.52.9药物-脂质比（D/L）2:102:10内相磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺含量/mg/ml1.91.9包封率/%98.298.1粒径/nm101.3±0.02101.7±0.06保存条件4℃保存，避光对照品：长春新碱原料药缩写Free含量97.7%干燥湿重6.9%外观性状白色粉末保存条件-20℃避光保存稳定性24个月批号100151提供单位广州汉方现代中药研究开发有限公司4.5.4样品采集及处理脂质体样品：受试动物于尾静脉注射给药前及开始给药后5min、1、2、4、8、24和48h分别从眼眶静脉丛取血0.5ml，置肝素抗凝管中，3000rpm离心分离血浆，-20℃冻存备用。游离药：试动物于尾静脉注射给药前及开始给药后1min、2.5min、5min、1、2和4h分别从眼眶静脉丛取血0.5ml，置肝素抗凝管中，3000rpm离心分离血浆，-20℃冻存备用。长春新碱在血样中的浓度通过HPLC方法检测。20μl血样，加入460μl冰水冷却的甲醇，然后通过涡旋混匀，在-20℃沉淀至少1小时，在20000g下离心10分钟。收集上清液进行分析检测，进样体积为20μl。4.5.5试验结果图4-5药代动力学结果从图中可以看出，和长春新碱游离药相比，长春新碱脂质体延长了长药物在体内的循环时间。但两个脂质体处方plv-c-0.5-2、plv-c-2.9-2之间，没有明显的药动学上的差异。4.6不同脂质体处方对体内毒性的影响为了考察长春新碱制备成脂质体后，是否能达到预期目标——毒性低于游离药，通过毒性试验来比较长春新碱脂质体不同处方间和长春新碱游离药对小鼠产生的毒性作用。4.6.1方案设计文献资料显示长春新碱游离药单次静脉给药对小鼠的LD50为2.1±0.125mg/kg。因此本实验设计起始剂量为1.8mg/kg，共四个剂量，即1.8、2.4、3.2和4.2mg/kg。挑选健康、体重差异较小的KM雄性小鼠，随机分组，每组5只小鼠。分别单次由尾静脉给予不同量的药物。给药完毕后，将鼠放回鼠笼饲养，并观察动物死亡情况及一般状态，每天称重。观察周期14天。4.6.2动物及饲养KM雄性小鼠，18～22g，购于河北省试验动物中心。动物饲养于清洁级环境，动物自由摄食、饮水，室温20～25℃，湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间12h/12h，实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2008-1-003，合格证号：1206067。所有实验动物饲料及垫料均由河北省实验动物中心提供。4.6.3供试品和对照品供试品：长春新碱脂质体脂质体处方ABCDDSPE-PEG2.9药物-脂质比（D/L）1:102:101:102:10内相磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺含量/mg/ml0.981.90.971.9包封率/%99.698.298.998.1粒径/nm101.9±0.04101.3±0.02102.3±0.06101.7±0.06保存条件4℃保存，避光对照品：长春新碱原料药缩写Free含量97.7%干燥湿重6.9%外观性状白色粉末保存条件-20℃避光保存稳定性24个月批号100151提供单位广州汉方现代中药研究开发有限公司溶剂：5%葡萄糖注射液缩写5%INJGS含量5%规格100mL外观性状无色透明液体保存条件4℃保存稳定性24个月批号100323704提供单位石家庄四药有限公司选择理由临床使用溶剂4.6.4试验内容给药根据不同给药剂量对小鼠进行单次尾静脉注射给药，给药体积为20ml/kg，观察14天。观察指标一般状态观察：所有动物于试验期每天观察2次（给药当天给药前、后各1次，观察给药后动物反应；其它每天上、下午各1次），观察指标包括皮肤、被毛、眼、耳、鼻、口腔、胸部、腹部、泌尿生殖部、四肢等部位，以及呼吸、运动、泌尿、排便和行为改变等。体重：所有动物于试验前称重1次，挑选合适体重动物用于试验。给药后每天固定时间称量动物体重1次。死亡和濒死：死亡动物记录死亡时间，濒死动物注意增加观察频率，确定死亡时间。观察时间与频率：试验观察至给药后14天左右。评价指标最大耐受剂量（MTD）：在观察期内，动物没有出现死亡，不可恢复的毒性反应，或者体重减轻没有连续3天超过15%，该剂量即被认为是急性单次给药的最大耐受剂量（MTD）。4.6.5试验结果长春新碱脂质体多个处方和游离药的4.2和3.2mg/kg剂量组均在给药后第3天开始出现明显不良反应。不良反应基本相似，为后肢肌肉强直，无力，运动失调，而后瘫痪。脂质体A组和C组，以及游离药2.4mg/kg组小鼠也出现后肢肌肉强直，无力不良反应，个别鼠发现眼睑下垂和尿道口红肿现象，随给药时间延长有所恢复。据动物死亡情况和体重减轻大于15%评价MTD，本实验条件下各研究药物的MTD如下：表4-6长春新碱脂质体处方MTD结果脂质体处方ABCDFreeDSPE-PEG2.9药物-脂质比（D/L）1:102:101:102:10MTD＜2.4＜1.8从毒性试验的结果，长春新碱脂质体plv-c-0.5-2、pLV-c-2.9-1和pLV-c-2.9-2三个处方的最大耐受剂量均大于长春新碱游离药，说明脂质体处方能够降低长春新碱的毒性，且处方pLV-c-2.9-2的毒性最小。4.7不同脂质体处方的抗肿瘤活性比较根据长春新碱市售产品的适应症，我们选择白血病L1210腹水瘤模型考察不同脂质体处方的抗肿瘤活性，以评价长春新碱长循环脂质体能够达到目标产品质量，并为处方筛选提供初步的药理学依据。4.7.1方案设计无菌条件下抽取L1210腹水细胞，用生理盐水稀释到107个细胞数/mL，冰水浴放置备用。每只小鼠腹腔接种0.2mL，接种完毕后按接种顺序均衡分组。各组分别静脉给药，每次给药间隔2天，连续4次给药，给药容积为20mL/kg。剂量设定依据文献报道长春新碱的临床成人剂量1～2mg（或1.4mg/m2）最大不大于2mg；年龄大于65岁者，最大每次1mg；儿童2.0mg/m2；每周1次静脉注射或冲入。联合化疗是连用2周为一周期。1.4mg/m2换算成小鼠给药剂量为0.44mg/kg。长春新碱静脉给予小鼠的LD50为2.100±0.125mg/kg。预实验：⑴BALB/c雌性小鼠，每组2只，脂质体处方0.5%PEG，D/L=2。给药量8mg/kg组2只小鼠在给药后第3天体重减轻＞15%，第4天死亡。给药量4mg/kg组1只小鼠在给药后第10天体重减轻至41.8%，而后死亡。另一只小鼠体重减轻最低点在给药后第10天（37.2%），后逐渐恢复。⑵BALB/c雌性小鼠，每组3只，脂质体处方2.9%PEG，D/L=2。给药量为1.8mg/kg，给药两次，间隔3天。脂质体组与普通制剂相比对小鼠毒性无差异，体重减轻最低点在给药后的第5天（约10%），后逐渐恢复。剂量设计本实验设定给药剂量为1.8mg/kg，为求得最佳实验疗效结果，采用间隔2天，连续静脉给药4次。给药途径及给药途径选择理由：静脉给药，与临床给药方式一致给药量：根据最近一次的体重计算给药量。实验观察指标：动物体重、一般状况及死亡时间。统计方法：使用生存分析Survival的Kaplan-Meier过程对生存时间进行组间的两两比较。4.7.2供试品和对照品供试品：长春新碱脂质体各处方脂质体处方ABCDDSPE-PEG2.9药物-脂质比（D/L）1:102:101:102:10内相磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺含量/mg/ml0.981.90.971.9包封率/%99.698.298.998.1粒径/nm101.9±0.04101.3±0.02102.3±0.06101.7±0.06保存条件4℃保存，避光对照品：长春新碱原料药缩写Free含量97.7%干燥湿重6.9%外观性状白色粉末保存条件-20℃避光保存稳定性24个月批号100151提供单位广州汉方现代中药研究开发有限公司溶剂：5%葡萄糖注射液缩写5%INJGS含量5%规格100mL外观性状无色透明液体保存条件4℃保存稳定性24个月批号100323704提供单位石家庄四药有限公司选择理由临床使用溶剂其他试剂：RPMI1640培基（美国GiBco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；Trypsin（胰蛋白酶）1：250(Sigma公司)；白血病L1210细胞由中国科学院上海生命科学研究院提供。4.7.3动物及饲养BDF1雌性小鼠，7-8周，来源于北京维通利华实验动物中心。动物饲养于清洁级环境，动物自由摄食、饮水，室温20～25℃，湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间12h/12h。所有实验动物饲料及垫料均由河北省实验动物中心提供。4.7.4试验内容动物接种取体内接种传代6天的L1210小鼠，断颈处死，无菌条件下使用一次性无菌注射器抽取小鼠腹水，并以生理盐水稀释，显微镜计数，调整瘤细胞数为9.2×107个细胞/mL，细胞悬液置于冰水浴。挑选状态良好、体重范围接近小鼠，按体重进行分层（以1g为界）用于实验。无菌注射器抽取上述瘤细胞悬液，注入小鼠腹腔，接种体积为0.2mL，含瘤细胞约1.8×106个，动物按照接种时间先后顺序均衡分成6组。动物组别用记号笔标记于鼠盒上，每组动物以苦味酸标记于腹部皮毛。给药及观察接种肿瘤细胞24h后，分别按组静脉给药，给药容积为20mL/kg，多次给药组据当天体重给予药物。给药后动物正常饲养，每周测量鼠重3次，每天观察动物一般状态，存活情况。实验结果以动物平均生存时间、中位生存时间（既mediansurvivaltime，MST）和生命延长率ILS来评价药物的治疗效果，生命延长率公式为ILS=（给药组MST/对照组MST-1）×100%。实验观察至接种后30天。4.7.5试验结果结果显示与空白组和长春新碱游离药给药组相比，实验结束时各脂质体组动物体重均显著下降，除plv-c-2.9-2处方外，其余3个处方治疗组动物体重下降均大于15%。小鼠生存时间采用SPSS11.5统计软件Survival的Kaplan-Meier过程进行组间生存分析比较，与空白组和等剂量的游离药相比，各脂质体给药组均显著延长动物的生存时间（P<0.05），而多个脂质体处方给药组间比较，动物的生存时间无显著性差异。长春新碱脂质体各处方均对小鼠的生命延长率>50%。表4-7动物存活天数组别空白脂质体游离药0.5%ds-peg,D/L=1:100.5%ds-peg,D/L=2:102.9%ds-peg,D/L=1:102.9%ds-peg,D/L=2:101930（存活）191530（存活）10281627202893818191824941026171416155101513232596920152130（存活）1079182026111188131821141498101011动物数1088889存活动物000000平均生存9.0±0.519.5±2.018.5±1.519.5±1.522.0±2.510.5±1.0中位生存9.0±0.518.0±1.518.0±1.020.0±1.524.0±6.510.0±0.5结论：长春新碱脂质体可以显著改善长春新碱游离药对小鼠L1210白血病细胞腹水瘤的存活时间，但各脂质体处方疗效之间无明显差异。除plv-c-2.9-2组外，其余3个处方治疗组动物体重下降均大于15%。综上所述：从包封率和体外释放度方面，确定内相缓冲液为磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺，PEG-DSPE密度为0.5%或2.9%、药脂比为1:10或2:10。综合药代、药效及毒性的试验结果，PEG-DSPE密度为0.5%或2.9%，药脂比为1:10或2:10的处方均能延长长春新碱在体内的循环时间，且均能改善长春新碱对小鼠L1210白血病细胞腹水瘤的存活时间，但PEG-DSPE密度为2.9%、药脂比为2:10的处方毒性最小，即安全性最高。因此优选的长春新碱脂质体处方组分为：内相缓冲液为磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺、PEG-DSPE密度为2.9%、药脂比为2:10。4.8脂质体处方的初步稳定性考察脂质体是一种新型药物载体，通过合理的设计，它能提高药物的疗效，减少毒副作用，增加药物稳定性，并且通过不同的技术可以实现不同性质药物的装载。但脂质体的稳定性一直是一个难题，若在储存期间药物易从脂质体中向外渗漏，将大大限制其作为药物载体的应用。脂质体的稳定性跟脂质体的结构类型、温度、稀释效应、类脂膜的组成等很多因素相关，因此，为了保证制剂的药效和用药的安全性，一个好的脂质体处方应该在储存条件下稳定。本部分实验主要考察选择脂质体处方的稳定性，包括性状、pH值、粒径分布、包封率、含量、有关物质等指标的测定，从而评价其关键质量属性在储存过程中的变化。4.8.1稳定性研究加速试验与光照的影响取长春新碱脂质体注射液，分别放置在40℃±2℃恒温箱和光照箱（4500±500LX）中，于第5、10天取样，按稳定性重点考察项目检测，考察储存温度和光线对样品稳定性的影响。长期稳定性研究将三批供试品置于冰箱中，在温度2~8℃条件下放置，在试验期间于第0个月、3个月、6个月分别取样，按稳定性考察项目检测，评估样品的稳定性。4.8.2试验结果表4-8影响因素试验结果检测项目0天高温5天高温10天光照5天光照10天性状为乳白色混悬液为乳白色混悬液为乳白色混悬液为乳白色混悬液为乳白色混悬液pH值6.66.6粒径（nm）98.1±0.0498.7±0.0499.0±0.0597.9±0.0598.3±0.06包封率(%)98.498.1有关物质-总杂质（%）0.380.390.650.450.56含量（%）100.0100.699.599.9100.4表4-9长期稳定性结果检测项目时间（月）0136性状为乳白色的混悬液为乳白色的混悬液为乳白色的混悬液为乳白色的混悬液pH值6.5粒径（nm）98.1±0.0498.6±0.0499.2±0.0399.1±0.06包封率(%)98.198.398.297.9有关物质-总杂质（%）0.380.370.380.39含量（%）100.099.7100.5100.2结论：本品在40℃条件下放置10天后，总杂质增长0.3%；在光照（4500±500lx）条件下放置10天后，总杂质增长0.2%，结果表明本品对温度和光较为敏感，故样品应避光冷藏贮存。本品在2～8℃条件下，经长期6个月，各项指标均变化不大，证明本品在冷藏条件下放置6个月，稳定性良好。从稳定性的数据可以看出，依据长春新碱脂质体处方（内相缓冲液为磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺、PEG-DSPE密度为2.9%、药脂比为2:10）制备的脂质体样品，粒径大小适中，且分布均匀；包封率较高，且在冷藏条件下放置稳定，不易渗漏。4.9处方因素的更新风险评估根据处方开发的研究结果，对处方变量进行更新风险评估，见表4-10，并在表4-11中给出了依据。表4-10处方变量的更新风险评估药品CQA处方变量内相缓冲液种类培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）用量药物-类脂比率pH低低低粒径低低低包封率低低低体外释放度低低低含量低低低降解物质低低低表4-11处方变量风险降低的依据处方变量药品CQAs依据内相缓冲液种类包封率研究中发现磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为内相缓冲液的处方包封率均高于硫酸铵处方，且包封率均高于90%，因此该变量对包封率影响的风险较低。体外释放度研究中发现磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为内相缓冲液的处方释放速率均低于硫酸铵处方，更符合长循环处方要求，且改变其它变量对释放影响较小，因此该变量对释放率影响的风险较低。培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）用量包封率研究结果显示peg磷脂用量增加到8.3%会导致包封率下降，但在选用磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为内相缓冲液是包封率仍高于90%，最后确定peg用量为2.9%，与8.3%相差较多，因此该变量对包封率影响的风险较低。体外释放度研究结果显示在相同药脂比的条件下peg磷脂用量2.9%的处方的释放速率仅仅略微高于0.5%用量的处方，但趋势相同，因为两处方用量相差近6倍，因此该变量对释放率影响的风险较低。药物-类脂比率包封率研究结果显示在药脂比从0.2增加至0.3时包封率开始降低，但仍高于90%，最后确定药脂比为0.2，因此该变量对包封率影响较低。体外释放度研究结果显示在药脂比低的处方在其它变量相同情况下释放速率略高于药脂比高的处方，但趋势相同，且体内药代动力学基本一致，因此该变量对释放率影响的风险较低。

结论5.1总结本研究主要