外源基因的表达

外源基因的表达第1页，课件共54页，创作于2023年2月

基因重组的主要目的使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。第2页，课件共54页，创作于2023年2月基因工程技术的核心——基因表达技术。基因表达——是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。第3页，课件共54页，创作于2023年2月基因表达在原核生物与真核生物中的差别（1）原核生物表达系统基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA;与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。第4页，课件共54页，创作于2023年2月基因操纵子调节系统示意图

调节基因

启动基因

操纵基因结构基因

DNA

转录

（-）

RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

翻译

阻遏蛋白

蛋白质

诱导剂

控制区信息区操纵子第5页，课件共54页，创作于2023年2月（2）真核生物基因表达系统转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构。第6页，课件共54页，创作于2023年2月第三节外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统基因表达载体受体细胞第7页，课件共54页，创作于2023年2月基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。第8页，课件共54页，创作于2023年2月原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：

原核生物多为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。

生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。

内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。第9页，课件共54页，创作于2023年2月一、大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌——是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。第10页，课件共54页，创作于2023年2月大肠杆菌表达系统的优越性：①已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；③实验已经证明，许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。第11页，课件共54页，创作于2023年2月大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统（复制子、选择标记）外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统1、大肠杆菌基因表达载体第12页，课件共54页，创作于2023年2月（1）DNA复制及重组载体的选择系统①复制子复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。第13页，课件共54页，创作于2023年2月常见的复制子pMB1、p15A、ColE1：松弛复制型，每细胞质粒拷贝数10～20个。pSC101：严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存含不同类型复制子的不同质粒载体可以共存第14页，课件共54页，创作于2023年2月②选择标记目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。微生物表型选择标记显性标记营养缺陷型标记第15页，课件共54页，创作于2023年2月在基因克隆中绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，并且主要集中在氨苄青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。第16页，课件共54页，创作于2023年2月第17页，课件共54页，创作于2023年2月大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。第18页，课件共54页，创作于2023年2月（2）外源目的基因的转录系统这一系统包括启动子、抑制物基因和终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。第19页，课件共54页，创作于2023年2月①启动子启动子（promotor）：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。第20页，课件共54页，创作于2023年2月启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。调节基因

启动基因结构基因

DNA

RNA聚合酶

转录

mRNA

翻译

蛋白质第21页，课件共54页，创作于2023年2月外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物，而过长的转录产物不仅会影响到mRNA的翻译效率,同时也会使外源基因的转录速度大大降低，从而影响目的蛋白的翻译效率。因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表达的目的。第22页，课件共54页，创作于2023年2月②抑制物基因抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。第23页，课件共54页，创作于2023年2月通过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时机尤其重要。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。第24页，课件共54页，创作于2023年2月③转录终止子转录终止子（terminator）：是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。转录终止子的功能：一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。第25页，课件共54页，创作于2023年2月（3）蛋白质的翻译系统在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码子与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5′端非翻译序列和蛋白编码区的5′端序列等。例如：起始密码子与SD序列之间的距离：6～8bp，多数为7bpSD序列后面的碱基组成：为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高；为CCCC或GGGG是，翻译起始效率分别为最高的50%和15%。第26页，课件共54页，创作于2023年2月蛋白质的翻译系统核糖体结合位点（SD序列）翻译起始密码子翻译终止密码子第27页，课件共54页，创作于2023年2月①核糖体结合位点核糖体结合位点：是指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）。SD序列与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻译起着决定性的作用。核糖体与mRNA的结合程度越强，翻译的起始效率越高，而核糖体与mRNA的结合程度主要取决于SD序列与核糖体16SrRNA碱基的互补性，因此，在构建表达载体时，要尽可能使SD序列与16SrRNA序列互补配对。第28页，课件共54页，创作于2023年2月大肠杆菌SD序列的碱基组成为5′AGGAGG3′,其中以GGAG四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降。第29页，课件共54页，创作于2023年2月②翻译起始密码子起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。也有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如GUG、UUG等。第30页，课件共54页，创作于2023年2月③翻译终止密码子翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在大肠杆菌中，合成多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控，RF1识别终止密码UAA和UAG，而RF2识别终止密码UAA和UGA，由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。第31页，课件共54页，创作于2023年2月在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。第32页，课件共54页，创作于2023年2月不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的选择性。有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为主密码子，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为罕用密码子。如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。第33页，课件共54页，创作于2023年2月2、宿主菌重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因：大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。第34页，课件共54页，创作于2023年2月为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌。常见的大肠杆菌基因表达受体菌株第35页，课件共54页，创作于2023年2月3、常见的大肠杆菌表达系统（了解）Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。PL和PR表达系统：是以λ噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。第36页，课件共54页，创作于2023年2月（2）外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌中的表达产物：存在部位：细胞质、细胞周质或细胞外培养基中；表达形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白两种。第37页，课件共54页，创作于2023年2月①

包涵体蛋白包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体存在部位：细胞质、细胞周质包涵体荧光图第38页，课件共54页，创作于2023年2月包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。第39页，课件共54页，创作于2023年2月包涵体形成的本质——是细胞内蛋白质的不断集聚，主要包括三个方面：①折叠状态的蛋白质的集聚作用；②非折叠状态的蛋白质的集聚作用；③蛋白质折叠中间体的作用。第40页，课件共54页，创作于2023年2月以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是：易于分离纯化。因为包涵体的水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他蛋白区分开来；对蛋白酶表现出好的抗性。第41页，课件共54页，创作于2023年2月②

融合蛋白融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。*融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：①稳定性好；②表达效率高；③较易于分离纯化。第42页，课件共54页，创作于2023年2月③

寡聚型外源蛋白为提高外源蛋白表达量，在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。第43页，课件共54页，创作于2023年2月多表达单元的重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达相对分子质量较大的蛋白。多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达中等大小分子量的外源蛋白。多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达外源小分子蛋白或多肽。外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：第44页，课件共54页，创作于2023年2月④

整合型外源蛋白为防止外源基因随质粒丢失，将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。实现外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与染色体DNA完全同源的序列。此外，还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一起。第45页，课件共54页，创作于2023年2月为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内的质粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。第46页，课件共54页，创作于2023年2月⑤

分泌型外源蛋白外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入15～30个氨基酸组成的信号肽（signalpeptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。第47页，课件共54页，创作于2023年2月②分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。③简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。①分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：第48页，课件共54页，创作于2023年2月5、在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略高效表达外源基因须考虑的基本原则