生化分析仪学生闫

生化分析仪学生闫1第1页，课件共28页，创作于2023年2月临床生物化学检验方法

手工法自动生化分析仪法第2页，课件共28页，创作于2023年2月临床生物化学检验方法

◆

手工法

分类

●比色法---以生成有色化合物的显色反应为基础。

●

比浊法---以生成浊度化合物的反应为基础。二者均以朗伯-比尔定律(A=Kbc)为基础。求值

●

对照品比较法：CX＝（AX/AR）CR

●

吸收系数法：AX＝εCX→CX＝——×AX

●

比色法：标准曲线（吸光度纵坐标，浓度横坐标）1ε第3页，课件共28页，创作于2023年2月自动生化分析仪法---概念

自动生化分析仪是将过去生化分析中的取样、加试剂、混合、保温、比色、结果计算、书写报告等步骤的部分或全部由仪器自动来完成。它具有快速、简便、灵敏、准确、微量等特点。

第4页，课件共28页，创作于2023年2月

自动生化分析仪--构成

样品系统试剂系统反应系统（包括温控装置）清洗系统

比色系统（光学系统：光源、单色器、比色池、检测器等）程序控制系统第5页，课件共28页，创作于2023年2月自动生化分析仪---分类按其反应装置的结构可分为：

*

流动式自动生化分析仪：测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。存在较严重的交叉污染，结果不太准确，现已淘汰。

*

分立式自动生化分析仪：是每个待测样品与试剂混合间的化学反应都是分别在各自的反应皿中完成，不易出现交差污染，结果可靠。

第6页，课件共28页，创作于2023年2月

终点分析法

连续监测法

比浊测定法

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自动生化分析仪基本检测方法第7页，课件共28页，创作于2023年2月●终点分析法

★

一点终点法

有单/双试剂，即待测物与试剂反应达到终点时，测定吸光度，计算待测物的浓度。（总蛋白双缩脲法、白蛋白溴甲酚绿法、葡萄糖氧化酶法）

★

两点终点法（固定时间法）

即在样品与试剂混合后读取一个点A1，一定时间后读取A2：ΔA=A2-A1，比较标准和测定的ΔA值，求得待测物的浓度。在单试剂分析中，该法可以消除样品以及试剂的颜色、浊度的干扰。（血清肌酐苦味酸法）在双试剂分析中，该法还具有消除内源性物质测定的干扰：加入试剂1后读取A1，加入试剂2后读取A2：ΔA=A2-A1。

A1A2AnAC第8页，课件共28页，创作于2023年2月

在酶促反应速度恒定期（零级反应期/线性反应期--反应速度与酶浓度成正比）来连续记录一定反应时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速度计算出酶活力的大小和代谢物的浓度。

●

连续监测法(酶动力学法)

酶活性与反应速率成正比零级反应期曲线酶促反应进程曲线第9页，课件共28页，创作于2023年2月连续监测法(酶动力学法)

★

两点速率法记录在零级反应期内两个时间点的吸光度，用两个点的吸光度的差值（ΔA）除以时间（分):ΔA/min。

★

多点速率法

记录在零级反应期内多个时间点（每隔2-30s)

的吸光度（至少4个点，3个ΔA），求出单位时间内的反应速度：ΔA/min。

ACA1A3AnA2第10页，课件共28页，创作于2023年2月●

比浊测定法

自动化生化分析仪一般用透射比浊分析，其原理是在光源的光路方向测量透过光强度，多用终点法测定。血清特种蛋白如载脂蛋白、微量白蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白以及某些药物监测等。第11页，课件共28页，创作于2023年2月

生化分析仪基本参数及其应用

﹩方法类型

终点法/连续监测法。反应方向分正向/向上（吸光度增加）或负向/向下（吸光度减低）。如ALT、AST选用负向反应。

﹩温度

生化分析仪的恒温控制器有25℃、30℃、37℃三种温度，根据需要可

以任意选择。由于酶在达到最适温度以前（10℃-37℃），温度每升高10℃，反应速

率增加1-2倍，因此IFCC(国际临床化学联合会）推荐酶测定时的温度设置为37℃。

第12页，课件共28页，创作于2023年2月

﹩

波长

＊

单波长

●当测定体系中含有一种组分或在混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收波长无重叠时可选用。

●如果一个物质有几个吸收峰，可选用吸光度最大的一个波长，或者选择在吸收峰处吸光度随波长变化较少的某个波长。

第13页，课件共28页，创作于2023年2月＊

双波长

●当被检溶液混浊或存在较多的干扰物质时，会出现非特异性光吸收，使用双波长（主波长/辅助波长），以提高测定结果的准确性。

●

辅助波长主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。这些物质波长范围较宽,有较强的光吸收，常同测定波长有重叠。

●

辅助波长的设置原则：干扰物质在测定波长同辅助波长有相同的吸光度。

如以NADH或NADPH作为测定底物或产物的试验常采用340/380nm，因为血红蛋白340nm和380nm波长吸光度相同；免疫比浊常选用340/700nm。第14页，课件共28页，创作于2023年2月

◆

设置原则：样品与试剂比例不能随意改动，一般为1:10-1:100，可

根据比例缩小样品和试剂用量，但应结合仪器的特性进行设置。

●样品和试剂的最小加样量及加量范围：加量与仪器精度有关。●最小反应液的体积，即反应液液面高度不低于光度计光径的最小体

积（日立7170A最适反应体积180μl～380μl）。

●测定结果的重复性差和准确性。一般样品量不应少于3μl（2μl）。

一般来说，待测物质在样品中含量低的、生理波动范围大的，样品用量较大。如ALT和

AST的样品与试剂比例多为1：1O至1：20；血尿酸或高密度脂蛋白胆固醇其比例为1：50；而

待测物质在样品中含量高的，样品用量较小，如Trinder反应测定血清葡萄糖、胆固醇等，

样品与试剂比例多为1：1OO；方法灵敏、吸光度高的实验，样品与试剂比例更小，如白蛋白

BCG法，其比例常为1：200。﹩样品量和试剂量第15页，课件共28页，创作于2023年2月

●

样品稀释水：

样品、校准品的稀释洗出粘附在采样针内壁上的微量血清，减少加样误差

●

试剂稀释水：

浓缩试剂的稀释

冲洗加试剂探针，避免试剂间交叉污染。

两种稀释水的用量不宜太多，以免试剂过度稀释影响反应，稀释水量应纳入样品试剂比例和反应液总体积考虑。

﹩稀释水量

第16页，课件共28页，创作于2023年2月

●应考虑干扰问题

在白蛋白溴甲酚绿法中，血清中α1-球蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白等亦可与溴甲酚绿呈色，但其反应速率较白蛋白为慢，因此在溴甲酚绿与血清混合后30s读吸光度可明显减少非特异性结合反应。

●

应考虑待测定物质结构问题

在葡萄糖氧化酶法中，葡萄糖氧化酶高特异性催化β-D-葡萄糖，而血清中葡萄糖α和β构型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反应，必须延长孵育时间使α-葡萄糖变旋为β构型。

●

应考虑反应速度问题

酶法测定总胆固醇、甘油三酯的Trinder反应，该反应37℃较慢，必须测定这些酶试剂反应达到终点的时间。自动分析仪所用试剂盒一般在全部加样后5min内反应完全，所以应该选择分析仪的最大反应时间。﹩孵育时间---

对终点法尤为重要

第17页，课件共28页，创作于2023年2月

连续监测法与两点法用。酶与底物混合后需要一定的时间让酶被激

活，直至线性反应期才能开始监测。酶促反应速率比较慢，可以是几秒

到几分钟，尤其是双底物反应或需要辅酶参与者，通常为1-3min。而一

般单试剂法只需30s。常用项目中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移

酶、肌酸激酶需要特别注意。

﹩监测时间

酶促反应延滞期后，在线性反应期（零级反应期），仪器开始监测。

连续监测法测定酶至少4点（3个ΔA，90-120s），求出单位时间内的反

应速率△A/min。（3个ΔA以上方可计算线性度）

﹩

延迟时间

第18页，课件共28页，创作于2023年2月

●

作用：判断试剂质量，超过某一吸光度值试剂失效。

●正向反应：试剂吸光度上限，可参考试剂盒说明书数值并根据比色杯的

光径折算成实际数值。如试剂盒要求上限为0.9，比色杯光径0.8cm，则试

剂吸光度上限设置为0.72（二者乘积）。

Trinder反应以酚和4-氨基安替比林作用生成的红色色素，试剂有一

定的自发氧化，一般要求其吸光度上限≤0.4；以结合型硝基苯衍生物作

为底物的ALP和GGT常要求≤0.8.

●负向反应：试剂吸光度下限，设置方法同试剂吸光度上限。

如以NADH或NADPH为辅酶的ALT和Urea（紫外法）等试验，一般要求试

剂吸光度下限≥1.0，0.8cm比色杯，下线应设置0.8。

﹩试剂吸光度上限、下限

第19页，课件共28页，创作于2023年2月

﹩底物耗尽限额

●连续监测法和两点终点法

●

不同型号分析仪的设计不一样：

▲

零点与监测第一点吸光度的差额

▲

吸光度上升或下降至指定吸光度的数值

●

超过限额说明样品的酶活性非常高，底物消耗太快，导致结果偏低，样品应稀释5-10倍后重新测定。此参数对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。第20页，课件共28页，创作于2023年2月

●

线性度：校准曲线接近规定直线的吻合程度，又称

“线性误差”

ΔK

=（K1-K2）/K3×100%

（K1为前2/3读数时间的斜率，K2为后2/3读数时间的斜率，K3为总的斜率）

●ΔK一般设为±15%。ΔK过大，说明曲线已

不成线性，表明底物不足，检测

结果会变低，应稀释后重测。

（有些不需要检查线性度时设为0）

﹩

线性度

ACA1A2A3A4●●●●0第21页，课件共28页，创作于2023年2月﹩试剂空白速率

●

连续监测法

●

即试剂在监测过程中底物自动降解得到的结果。其值为以水代样品测得的结果，最后样本测定结果应扣除试剂空白速率。

（生化分析仪在加R2试剂之前检测吸光度变化即为试剂空白速率）

第22页，课件共28页，创作于2023年2月

﹩

线性范围

●

按试剂的质量而设置，超过范围应增加样品量或稀释后重测。

●不同样品试剂比的线性范围也不一样，应实测试剂盒的线性范围：

终点法可配制系列不同浓度的标准液，按分析项目的波长、样品量、试剂量、孵育时间，测定各浓度的吸光度，绘制标准曲线，在线性内的最高浓度为线性上限。第23页，课件共28页，创作于2023年2月

●

理论F值

酶活性测定时，可根据摩尔消光系数进行酶活性的计算。先测定在线

性范围内每分钟吸光度的变化（ΔA/min），以U/L代表酶活性浓度时，则

可按下式进行计算：

U/L=ΔA/min×V×106/(ε×v×1)

U/L=ΔA/min×F（F=V×106/(ε×v×1)）

（式中V：反应体系体积（ml）；ε：摩尔吸光系数（L/mol.cm）；v：样品量

（ml）；l：比色杯光径（cm）；ΔA：吸光度变化；106：将mol换算成μmol）

●

实际F值

实际工作中，仪器诸多因素如波长的准确性、比色杯光径及磨损与

清洁度、温控的准确性、加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会

影响测定物的ε值或上述公式中的相关项。因此，应在具体仪器条件

下，定期检查和实际测定F值。

﹩计算因子F值（K）第24页，课件共28页，创作于2023年2月

﹩

前区检查

●

应用：免疫比浊法

●

比较免疫比浊分析过程中前后两个读数点的差别，如果后一点比前一点的吸光度低，则表示抗原已过剩，应将样品稀释后重测。

“Hook”A1A2●●第25页，课件共28页，创作于2023年2月﹩

线性方程

●

仪器常数：Y=ax+b，用于校正检验结果，一般a为1.000，b为0.000，必要时根据试剂说明书设定。

●

如果测试方法不完全成线性，以标准液代替样品在仪器上测得的结果为横坐标，标准液的实际浓度为纵坐标绘制而成的曲线，其中b为曲线在纵轴上的截距，a为曲线的斜率，回归曲线，以修正检验结果。

第26页，课件共28页，创作于2023年2月

小结参数终点分析法连续监测法比浊测定法

温度

√√√波长

√√√样品量和试剂量

√√√稀释水量

√√√孵育时间

√延迟时间

√监测时间