克隆基因的表达及基因干扰课件

第七章克隆基因的表达及基因干扰

上海交通大学倪培华1第七章克隆基因的表达及基因干扰

第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术2023/7/162第一节外源基因的表达3第一节外源基因的表达二、真核生物表达体系一、原核生物表达体系

2023/7/164一、原核生物表达体系

（二）原核表达载体具有的特点（四）包涵体（一）对外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核细胞中的表达2023/7/165一、原核生物表达体系

（一）对外源目的基因的要求

不应具有5´端非编码区以及内含子结构2023/7/166

选择标志启动子翻译起始点和终止序列多克隆位点（二）原核表达载体具有的特点一、原核生物表达体系

2023/7/167一、原核生物表达体系

（三）真核生物基因在原核细胞中的表达1.非融合型表达蛋白2.融合型表达蛋白3.分泌型表达蛋白2023/7/1681.非融合型表达蛋白优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏（三）真核生物基因在原核细胞中的表达

一、原核生物表达体系

2023/7/169常用的非融合型表达蛋白表达原核载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因Tac启动子SD序列AUG起始密码转录终止序列T1和T2一、原核生物表达体系

2023/7/1610一、原核生物表达体系

2.融合型表达蛋白优点：融合蛋白具有抗原性可以作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏2023/7/1611一、原核生物表达体系

融合型表达系统主要有His系统GST系统金黄色葡萄球菌蛋白A系统β-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统2023/7/1612一、原核生物表达体系

3.分泌型表达蛋白

可防止大肠杆菌对表达产物的降解，而且能够减轻大肠杆菌代谢负荷和易于恢复表达产物天然构象2023/7/1613（四）包涵体1.包涵体的形成2.包涵体的分离与纯化3.包涵体的复性一、原核生物表达体系

2023/7/1614二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系2023/7/1615二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系

1.酵母表达载体2.酵母表达外源性基因的形式

2023/7/1616二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系

1、酵母表达载体选择性标志复制子启动子上游活性序列终止序列蛋白结构域2023/7/1617二、真核生物表达体系2.酵母表达外源性基因的形式非分泌型分泌型2023/7/1618二、真核生物表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系1.哺乳动物细胞表达载体2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统2023/7/1619（二）哺乳动物细胞表达体系1.哺乳动物细胞表达载体

(1)原核DNA序列

(2)启动子

(3)增强子

(4)剪接信号

(5)遗传标记

(6)终止信号和多聚腺苷化的信号二、真核生物表达体系2023/7/1620二、真核生物表达体系细胞系DNA转染方式最初的应用CV-1SV40病毒感染表达野生型、突变蛋白CV-1/293腺病毒感染表达野生型、突变蛋白COS瞬时DEAE-葡聚糖在哺乳类细胞中表达，快速鉴定cDNA克隆，表达突变蛋白。NIH3T3逆转录病毒感染转基因动物、在不同类型细胞中表达鼠成纤维细胞MOP瞬时DEAE-葡聚糖快速鉴定cDNA克隆表达突变蛋白CHO-DHFR稳定DHFR+转染用氨甲喋呤扩增高效稳定表达灵长/啮齿类痘病毒疫苗神经元细胞EB病毒载体HSV病毒载体克隆表达基因转移2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式2023/7/16213.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统（1）COS细胞瞬时表达系统（2）CHO细胞稳定表达系统二、真核生物表达体系2023/7/1622第二节表达产物的分离、纯化与鉴定23第二节表达产物的分离、纯化与鉴定二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化三、表达产物的鉴定一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化2023/7/1624一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化

1.粗制品的分离纯化

2.精制品的分离纯化2023/7/1625二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化

1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化

2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化2023/7/1626三、表达产物的鉴定

1.蛋白质样品的制备2.SDS聚丙烯耽胺凝胶电泳3.蛋白质的电转移2023/7/1627四、表达产物的鉴定

4.靶蛋白的免疫学检测封闭靶蛋白与第一抗体反应与第二抗体反应显色2023/7/1628四、表达产物的鉴定

2023/7/1629四、表达产物的鉴定

2023/7/1630第三节基因表达干扰技术31第三节基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶三、小干扰RNA四、微RNA一、反义核酸技术2023/7/1632一、反义核酸技术

（二）反义RNA技术

（三）反义核酸技术的应用（一）反义寡核苷酸技术2023/7/1633一、反义核酸技术（一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制2.反义寡核苷酸的设计与合成3.反义寡核苷酸的修饰4.反义寡核苷酸的给药途径2023/7/1634一、反义核酸技术（一）反义寡核苷酸技术

1.反义寡核苷酸的作用机制

(1)抑制mRNA的翻译

(2)抑制复制或转录

(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达2023/7/1635一、反义核酸技术2、反义寡核苷酸的设计与合成

1）设计①计算机软件预测RNA的二级结构②利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计

2023/7/1636么么么么方面Sds绝对是假的一、反义核酸技术2）合成①长度一般为15～25个核苷酸②G-C含量为60%～65%2023/7/1638一、反义核酸技术3.反义寡核苷酸的修饰最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰（1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子（2）甲基修饰磷酸骨架（3）聚酰胺键代替磷酸骨架2023/7/1639一、反义核酸技术4.反义寡核苷酸的给药途径（1）直接作用于培养细胞（2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径2023/7/1640一、反义核酸技术（二）反义RNA技术

1.反义RNA的作用机制2.反义RNA的设计2023/7/1641（二）反义RNA技术

1.反义RNA的作用机制(1)抑制DNA复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运(3)抑制mRNA翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解一、反义核酸技术2023/7/1642一、反义核酸技术2.反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单2023/7/1643（三）反义核酸技术的应用需要完善或解决的问题：①防止被核酸酶降解②需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合④ASON是否会影响正常细胞的基因表达⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题一、反义核酸技术2023/7/1644二、核酶与脱氧核酶（一）核酶（二）脱氧核酶2023/7/1645二、核酶与脱氧核酶（一）核酶1.核酶的分类2.核酶的结构3.核酶的设计与修饰4.核酶转移方法5.核酶的应用2023/7/1646二、核酶与脱氧核酶（一）核酶

1.核酶的分类（1）大分子核酶：第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P

（2）小分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和

neurosporaVarkudsatellite核酶

2023/7/1647

2.核酶的结构（1）锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心二、核酶与脱氧核酶2023/7/1648（2）发夹形核酶：每个结构域由螺旋-环-螺旋组成二、核酶与脱氧核酶2023/7/1649二、核酶与脱氧核酶（二）脱氧核酶1.脱氧核酶的结构种类及特征2.脱氧核酶的催化特性3.设计合成脱氧核酶的原则4.脱氧核酶的应用2023/7/1650二、核酶与脱氧核酶（二）脱氧核酶

1.脱氧核酶的结构种类及特征（1）10-23型脱氧核酶：

2023/7/1651二、核酶与脱氧核酶

（2）8-17型脱氧核酶：2023/7/1652二、核酶与脱氧核酶2.脱氧核酶的催化特性（1）RNA切割活性（2）DNA连接酶活性（3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性（4）DNA切割活性（5）N-糖基化酶活性（6）DNA激酶活性（7）DNA戴帽活性2023/7/1653二、核酶与脱氧核酶3.设计合成脱氧核酶的原则

（1）总核苷酸数不超过50

（2）催化效率不低于核酶（3）具有广泛的RNA切割功能（4）能通过碱基配对与底物结合（5）具有可重复性2023/7/16544.脱氧核酶的应用

为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径二、核酶与脱氧核酶2023/7/1655三、小干扰RNA

（二）RNAi的作用机制

（三）siRNA的设计原则

（四）siRNA的制备方法（六）RNAi沉默效果的检测

（一）一般研究路线（七）RNAi的应用（五）siRNA的导入2023/7/1656（一）一般研究路线三、小干扰RNA

2023/7/1657三、小干扰RNA

（二）RNAi的作用机制

1.起始阶段

2.效应阶段

3.倍增阶段2023/7/1658三、小干扰RNA

2023/7/1659三、小干扰RNA

2023/7/1660三、小干扰RNA（三）siRNA的设计原则

1.siRNA中G+C碱基含量

2.siRNA作用位点

3.siRNA序列

4.siRNA碱基数

5.环碱基数

6.对照系统2023/7/1661三、小干扰RNA（四）siRNA的制备方法

1.化学合成法

2.体外转录法

3.RNaseⅢ消化法

4.siRNA表达载体法

5.siRNA表达框架法2023/7/1662三、小干扰RNA2023/7/1663三、小干扰RNA2023/7/1664siRNA的合成方式及特点化学合成法体外转录法RNaseⅢ消化法siRNA表达载体法siRNA表达框架法核酸特征21～23nt双链RNA29nt双链DNAT7启动子后200～800bp的转录模板55～60bp双链DNA≤50bp双链DNA制备时间4天制备DNA双链后24小时制备转录模板后24小时制备双链DNA后5天制备DNA后约6小时转染时间短中等中等长中等测序需要需要不必需要需要标志可以可以可以不可不可转染难易程度容易容易容易非常容易非常容易大规模制备可以有限有限可以有限抗性筛选不可不可不可可以不可抑制作用时间短短短长短费用较高中等较低中等中等三、小干扰RNA2023/7/1665三、小干扰RNA（五）siRNA的导入

1.脂质体或电穿孔

2.病毒携带

3.细胞穿透肽（六）RNAi沉默效果的检测（七）RNAi的应用2023/7/1666四、微RNA

（二）miRNA的作用机制

（三）siRNA与microRNA的区别（四）miRNA的生物学功能

（一）miRNA的命名2023/7/1667四、微RNA

miR-#（#代表