植物组织培养植物胚胎培养课件

第八章植物胚胎培养第八章植物胚胎培养植物胚胎培养是指对植物的胚及胚器官(如子房、胚珠、胚乳等)进行离体培养，使其发育成幼苗或者离体研究植物胚胎发生机理的生物技术。植物胚胎培养为揭示植物胚胎形成机理、克服植物远缘杂交不育、不实、自交不亲和等生殖障碍、扩大植物遗传物质交流以及利用胚组织建立植物体细胞无性系等研究提供了新的途径和方法。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。种子的结构胚的发育第一节离体胚培养第二节胚珠和子房培养第三节离体授粉、受精与合子培养第四节胚乳培养第八章植物胚胎培养第一节离体胚培养一离体胚培养的概念和发展1.离体胚培养的概念

离体胚培养(embryoculture)是指从植物种子中分离出胚组织进行离体培养的技术。2.离体胚培养的发展胚胎培养已有近百年的历史：

1904年，Hanning最早成功地培养了萝卜和辣根菜的成熟胚，并萌发形成小苗。

1907年，Stingl发现几种禾本科植物的胚乳彼此嫁接时，胚仍能生长良好，因此认为，胚不一定依赖本身的胚乳取得营养。

1925年，Laibach在亚麻属两个种间杂交得到的不萌发的种子胚取出，进行离体培养，发现胚能萌发并能长成植株。这一研究给植物远缘杂交提供了一个启示：在杂交不亲和的情况下，把胚在早期取出培养，有可能使杂交获得成功。

30年代,Tukey成功地培养了多种果树的胚胎，并获得成功。兰科植物的胚培养成小植株。从40年代开始，离体胚培养在多种植物上获得了成功，如苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展。二离体胚培养的一般方法离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚培养和幼胚培养。1.成熟胚培养

成熟胚是指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子用70％酒精进行几秒钟的表面消毒→无菌水冲洗3-4次→无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。

培养基：

WhiteTukeyMS

无机盐+糖(1-2%)+生长辅助物质(激素、氨基酸、活性炭、维生素等)成熟胚培养过程--以玉米成熟胚培养为例1）玉米种子消毒2）在黑暗条件下，将种子放在无菌湿润的含滤纸的培养皿中培育6hr。3）将吸涨的种子在无菌培养皿内将胚分离出来4）无菌水冲洗3次5）在MS培养基中暗培养。6）观察：2d出现胚根，3-4d出现胚芽，10d长成幼苗。玉米成熟胚的培养2.幼胚（未成熟胚）培养：

幼胚是指子叶期以前的幼小胚。

由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.1～0.2mm）胚越小就越难培养

幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等

（1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：

a.继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；

b.早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；

c.胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。

（2）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同，值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的胚。

幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。

通常存在的影响条件如下：

a.培养基

幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有Tukey，Nitch、MS，B5培养基；需要较高的蔗糖浓度，以提供较高的渗透压

b.生长调节物质

不同植物的胚培养需要的生长物质不同，如IAA可明显促进向日葵胚的生长；IAA，KT的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会c.天然提取物的作用

椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长）一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力d.温光条件

对于大多数植物的胚来说，在25-30℃为宜早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃为好。光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。5.其它条件

胚培养中除要求较高的蔗糖浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。

三离体胚培养的应用1.胚拯救离体胚培养是远缘杂交育种中进行杂种胚拯救的有效手段。在远缘杂交中，常因胚的发育不良或胚乳不能正常发育以及胚与胚乳之间的不协调等原因导致杂种不育。如果将这类杂种的胚在适当的时期取出进行离体培养，就可以使其继续生长，从而获得杂种后代。2.核果类胚的后熟作用早熟的核果类果实往往产生没有生活力的种子，无法得到后代。采用胚的离体培养就可以得到其后代。如中科院植物所利用胚胎培养获得早熟桃新品种“京早三号”时，用旱生水蜜×桔旱生进行杂交，待果实长到硬核期采下，在低温2-5℃处理60天，然后进行幼胚培养。3.克服种子休眠

有的植物种子成熟后要休眠2-3年才能萌发，如果将胚取出后放到人工合成培养基上，几天内就能萌发，大缩短了育种年限。4.使胚发育不全的植株获得大量的后代兰花、天麻等一些植物在种子成熟时，种子中包含着未分化的胚，有的胚只有6-7个细胞，大多数不能成活，如把胚分离出来放在培养基上培养，胚就能继续生长发育成正常的植株。

5.用于某些植物杂种胚的繁殖胚培养对于一些具有珠心胚（如柑橘、芒果等）的植物具有特殊的意义。这些植物都存在着珠心胚，可以达到50多个以上。在柑橘杂交育种中杂交往往得不到杂种胚，因为杂种胚的生活能力比较差，而珠心胚生存能力比较强，其生长抑制了合子胚的生长。这种情况下，必须把杂种胚取出来进行离体培养，才能获得杂种后代。6.用于有关理论研究用于胚胎发育过程、影响胚发育的各种因素、胚乳作用以及相关代谢、生理等研究。

第二节胚珠和子房培养有些物种间的杂种胚在发育到心形期或比这一时期更早的时期即可能夭折，而在此之前剥离出来在技术上是十分困难的。在这种情况下，胚珠培养（OvuleCulture）或者子房培养（OvaryCulture）对于获得杂种或繁殖就有很大的潜在价值。授粉后胚珠和子房培养是对植物授粉后一定时间内植物胚珠或子房离体培养，诱导胚珠或子房内合子或早期胚胎进一步发育并再生出植株的过程。这一技术为拯救心形期或心形期以前的胚胎提供了新的途径。一胚珠培养（一）定义：

胚珠培养（OvuleCulture）是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。第二节胚珠和子房培养柱头花柱子房花梗花托花组成胚囊卵细胞株心珠孔反足细胞珠被胚珠极核

株柄（二）意义：

胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。

（三）培养技术：

从花中取出子房→→70%酒精消毒30秒→→无菌水冲洗→→5%次氯酸钠液中灭菌10分钟→→无菌水冲洗数次→→在无菌条件下进行解剖→→取出胚珠→→放在培养基上→→培养

基本培养基：用Nistch培养基

MS、N6、B5等培养基也可采用关键：选择胚的发育时期——球形胚期的胚珠较易培养成功（四）发育方式：未受精胚珠受精胚珠愈伤组织发育成种子大孢子或卵分化为单倍体植株再生植株1.取材：

开花前1－5天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。二子房培养（OvaryCulture）2.灭菌：

材料处理(禾谷类植物用70%酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌15分)→→70%酒精浸30秒→→无菌水冲洗→→0.1%升汞15－20分钟→→无菌水冲洗→→无菌滤纸吸干。3.接种：无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、N6等）。4.培养：温度26℃,相对湿度50-60%，16h散射光。三离体胚珠和子房的发育离体胚珠和子房的植株再生有两种途径：

1.在离体培养条件下，合子胚在胚珠内继续发育至成熟，最终成熟胚在胚珠萌发，形成小植株；如棉花等。

2.离体子房或胚珠内的幼胚等组织脱分化，产生愈伤组织，经诱导后，愈伤组织形成体细胞或经器官发生，再形成小植株；如柑橘等。四胚珠和子房培养的应用1.克服远缘杂交中杂种早亡2.用于试管授粉3.创造雌核发育的单倍体4.获得大量的体细胞胚5.繁育无核植物的珠心苗第三节离体授粉、受精与合子培养一植物离体授粉、受精与合子培养的概念

植物离体授粉(Pollinationinvitro)指在离体条件下对雌蕊的柱头、带胎座的胚珠和单个胚珠进行人工授粉和完成受精并形成种子的过程。

离体受精(Fertilizationinvitro)指游离的植物精细胞和卵细胞融合形成合子，进一步培养使其形成植株的技术。植物离体授粉、受精也叫植物试管受精。

合子培养(ZygoteCulture)是指对离体受精的合子或分离的自然受精合子进行离体培养，并使其进一步发育成植株的技术。二离体授粉1.离体授粉的一般方法(1)花粉的收集将要开花的幼穗或花蕾，经过常规消毒后在无菌条件下让花药自然开裂，用无菌培养皿或滤纸收集撒出来的花粉，用于体外授粉。(2)子房或胚珠的剥离在开花前1天将雌穗或花蕾取下，经过常规消毒后在无菌条件下录取完整子房或胚珠，并及时转入培养基。(3)授粉第一种方式：将子房接入培养基，然后用毛笔粘取收集的新鲜花粉，涂在雌蕊的柱头上。第二种方式：在子房剥离后，可直接用子房的柱头直接粘取花粉或用毛笔在管外子房柱头上涂上花粉后再接入培养基中培养。(4)培养一般情况下，试管授粉培养物在黑暗中或散光条件下培养，培养温度一般在25-28℃。

2.影响离体授粉的因素亲本组织柱头和花柱雌蕊的生理状态Ca2+的作用Ca2+

离子具有刺激花粉萌发和花粉管生长的作用授粉方式三植物离体授粉、受精与合子培养的应用1.克服远缘杂交不育2.克服自交不亲和3.在诱导单倍体植株上的应用4.用于花粉生理和受精生理的研究第四节胚乳培养一胚乳培养的概念和发展胚乳培养(endospermculture)是指分离被子植物的胚乳组织进行离体培养，使其经过脱分化和再分化形成植株的过程。糊粉层

胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织。由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。

胚乳的离体培养研究始于20世纪30年代，Lampe和Mills(1933年)进行了被子植物胚乳离体培养的最初尝试，他们培养了玉米未成熟胚乳，发现靠近胚的胚乳层组织能增殖，虽然没有培养成功，但指出了胚乳培养的可能性。

LaRue等对胚乳组织在离体培养中的生长和分化进行了长达9年的深入研究，于1949年报道了玉米未成熟胚乳进行离体培养，能够不断产生愈伤组织，但未分化出器官。

胚乳培养的发展直到1965年，Johri和Bhojwani在檀香科寄生植物柏形外果的研究中第一次发现胚乳离体培养可以直接分化出三倍体的植株。这一发现有力推动了胚乳培养研究的发展，导致70年代胚乳培养研究的高峰时期，陆续有多各植物的胚乳离体培养获得成功。胚乳培养的发展1.取材与接种

取授粉4-8d后的幼果→常规消毒→在无菌条件下切开果实→取出种子→分离出胚乳→接种

2.培养基

MS、White

2,4-D、NAA（0.5-2.0mg/L）

6-BA0.1-1.0mg/L

二胚乳培养的一般方法培养

在25-27℃和黑暗条件或散射光下培养约6-10d胚乳开始膨大→形成愈伤组织→分化培养基上（附加6-BA0.5-3.0mg/L及少量的NAA）培养→待愈伤组织长出芽后，切下不定芽→生根培养基→光下培养10-15d，切口处可长出白色的不定根。

胚乳培养过程胚乳胚状体发育成苗不定芽苗愈伤组织形态发生三、影响胚乳培养器官发生的因素1.胚乳的发生类型和发育时期

处于旺盛生长的胚乳，在离体条件下最容易诱导产生愈伤组织。

只有当胚乳充分发育到细胞时期才能诱导产生愈伤组织，而超过一定时期，就不能诱导产生愈伤组织。2.胚在胚乳培养中的作用

胚乳细胞的脱分化及其进一步发育不一定要有胚的存在，但当有胚存在时，可以明显提高胚乳愈伤组织的诱导频率。3.基因型

研究证明，同一种植物不同品种的胚乳培养难易程度不同，因此材料的基因型对于胚乳培养能否成功非常重要。4.创伤和接种方式

创伤能提高胚乳对培养的反应水平。此外，胚乳的接种方式对茎芽分化和分布也有显著的影响。不论接种方式如何，茎芽总是先在伤口处出现。四、胚乳再生植株的染色体倍数