HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用培训课件

HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用2基于分离分析科学技术小颗粒填料的色谱柱以光谱、质谱技术作为检测手段专属性、分离效率及灵敏度适用于广泛的色谱应用适用于开发新方法适用于现有方法的改进HPLC及HPLC/MS法HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用3质量源于设计（QualitybyDesign，QbD）准则实验设计方法学（DesignofExperiment，DoE）方法验证（MethodValidation）：确保方法在样品分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。分析方法学的开发及验证HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用4方法开发实验室获得方法及运用过程方法验证方法确认方法转移准确度，精密度，专属性，检测限，定量限，线性，范围，耐用性分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等）及优化（梯度、柱温、流速等）法定检验方法在使用环境中适用性评估（人员、仪器、样品、试剂）非法定检验方法在实验室之间传递的文件化过程HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用5实验室获得方法及运用过程方法验证方法确认-用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法用一个确定方法来挑战现实的分析环境专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ一般不需要进行线性，范围，耐用性实验HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用6ICH、USP<1225>、ChPIIAppendixXIXA方法验证的内容准确度（Accuracy）精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度专属性（Specificity）检测限（LOD）定量限（LOQ）线性（Linearity）范围（Range）耐用性（Robustness）HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用7方法验证-系统适用性系统适用性试验的内容在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系统之性能达到规定的要求塔板数，拖尾因子，分离度确定重现性（%RSD）系统适用性“样品”主组份与预期副产物之混合物系统适用性试验是色谱方法的一部分HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用8方法验证-系统适用性容量因子k'>2精密度/进样重复性RSD1%,n5分离度Rs2(主峰与最近洗脱的色谱峰之间)拖尾因子T2理论塔板数通常

N>2000HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用9方法验证-USP<1225>类型1主组份或活性成份定量分析方法类型2杂质或降解化合物测定方法类型3性能特点之确定分析方法如溶出度实验类型4鉴别试验HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用10方法验证-USP<1225>验证的内容类型1定量

限度试验类型3类型4鉴别试验准确度++**-精密度++-+-专属性+++*+检测限--+*-定量限-+-*-线性++-*-范围++**-类型2*可能需要，具体与特定试验的性质有关。HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用11如何进行方法验证分析实验阶段按照规定的实验计划或步骤通常需要3到5天在不同操作条件下，进不同浓度的试样原料及制剂皆需分析数据分析阶段对分析结果进行统计学计算色谱结果是相对的用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真实变化HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用12方法验证步骤线性Day1-3定量限检测限实验参数2Min&Max耐用性实验参数3Min&Max实验参数4Min&Max六次空白样品的基线噪音定量限精密度定量限原料药浓度4原料药浓度3原料药浓度2原料药浓度1原料药浓度5原料药精密度1-3天六次重复,100%原料药实验参数1Min&Max浓度4:120%原料及制剂浓度3:100%原料及制剂浓度2:80%原料及制剂浓度1:60%原料及制剂浓度5:140%原料及制剂HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用13每一方法验证的过程由80到100次分析组成每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分离度等……）每一组分最终得到总共约700个数字所有这些数字需要进行数学处理：手工处理（计算器，ExcelMacro’s等）专用的方法验证程序方法验证的复杂性HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用14液相色谱的方法开发HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用15液相色谱的方法开发根据分析物的化学性质选配色谱条件基于既往经验及思考进行合理猜测通常辅以资料参考询问同事“步进式”测试开发基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行系统性筛选策略先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试评估结果，选择最有效的条件组合再进行方法优化梯度/温度HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用16影响分离度的因素选择性最为重要MaximizedinUPLCSeparationsby:RangeofcolumnchemistriesMultipleparticlesubstratesWideusablepHrangeHighretentivityWiderangeinselectivityMaximizedinUPLCSeparationsby:Ultra-lowdispersionsystemSmall[<2µm]particlesHigherpressurecapabilityWell-designedcolumnsPhysicalChemicalImpactonResolution

DoubleNDoublekDoubleα%Improvement

20–40% 15–20% >400%HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用17影响分离度的因素HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用18UPLC技术加速方法开发过程能够在一个工作日内完成方法开发!对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行系统性筛查高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨分离在更快的同时分离能力不打折扣可自动选择色谱柱和流动相四元溶剂或二元混合使方法开发更方便HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用19固定相有机溶剂流动相pH值梯度影响选择性的主要因素HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用20固定相HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用21固定相Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane传统硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口硅羟基HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用22固定相键合相(配体)：C18残留硅羟基端基封口基团硅胶基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用23固定相FlMinutes0.001.202.403.604.80CSHC18CSHPhenyl-HexylCSHFluoro-PhenylHSSC18SBIAPFlFeDOIAPFlFeDOIAFlFeDOIAPFlFeDOPAcetonitrile,0.1%

formicacid(pH3)TestProbes:I:Imipramine[B]A:Amitriptyline[B]Fl:Flavone[N]O:Octanophenone[N]P:1-pyrenesulfonicacid[A]Fe:fenoprofen[A]D:diclofenac[A]HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用24固定相Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene铝杂质含量~375ppmTfUSP=6.5

流动相pH7传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用25固定相与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-

O-SiO-SiO-

O-SiO-

O-SiO-SiO-SiO-

O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基趋于中性(未解离)

BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统C8硅胶柱离子交换作用当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用26固定相低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！pH7.0pH2.0阿密曲替林去甲阿米替林HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用28固定相Minutes0246810流动相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物没有保留起始：填料完全浸润－“Wetted”停止流速后：填料完全脱离浸润状态－“De-Wetted”丧失浸润现象：

100%水溶液中保留完全丧失HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用29流动相甲醇质子化溶剂[氢键供给者]洗脱能力较乙腈弱粘度较乙腈高低紫外波长下有吸收乙腈非质子化溶剂[氢键接受者]洗脱能力较甲醇强粘度较甲醇低低紫外波长下透光性好HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用30流动相Jenkins,DiehlRP18LowpH(pH3)100%MeOH100%ACN1:1ACN:MeOH1243562879610121189101110,1112128,91672344315,751.Gentisicacid(A)2.Caffeine(WB)3.Ritodrine(B)4.Hydroguinidine(B)5.1-Pyrenesulfonicacid(A)6.Imipramine(B)7.Amitriptyline(B)8.Flavone(N)9.4-Dimethylamino-benzophenone(WB)10.Diclofenac(WA)11.Dioseb(A)12.Octanophenone(N)HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用31流动相pH值影响带有可离子化官能团的分析物胺羧基酚有些化合物含有一个以上的可离子化官能团改变流动相pH将使选择性发生极大改变HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用32流动相pH值酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大中性化合物的保留不受pH影响SilicapHRangeHybridParticlepHRangeNeueet.al.AmericanLaboratory1999(22)36-39.pH0510152025303540024681012RetentionFactor(k)酸性碱性中性化合物碱性保留增强[B]酸性保留增强[HA]HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用33固定相、溶剂和流动相pH的影响因素IAPFlFeDOFluoro-PhenylpH3,MeOHPC18pH3,ACNIAPFlFeDOIAFlFeDOC18pH10,ACNPhenyl-HexylpH10,MeOHIAPFlFeDOTestProbes:I:Imipramine[B]A:Amitriptyline[B]Fl:Flavone[N]O:Octanophenone[N]碱性及中性化合物HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用34固定相、溶剂和流动相pH的影响因素IAPFlFeDOFluoro-PhenylpH3,MeOHPC18pH3,ACNIAPFlFeDOIAFlFeDOC18pH10,ACNPhenyl-HexylpH10,MeOHIAPFlFeDOTestProbes:P:1-pyrenesulfonicacid[A]Fe:fenoprofen[A]D:diclofenac[A]酸性化合物HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用35固定相、溶剂和流动相pH的影响因素分析物在其未电离[中性]状态时保留较强甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到增强，同时也具有不同于乙腈的选择性当流动相pH值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的极大改变在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相pH因素综合时HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用36梯度洗脱优点单位时间的分离能力增加－较大的峰容量检测灵敏度提高缺点仪器设备要求