分枝杆菌属、诺卡菌属、放线菌属鉴定-结核分支杆菌（微生物检验课件）

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)

俗称结核杆菌，引起人类结核病致病菌主要为结核分枝杆菌（M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)世界上1/3人感染，70%在亚洲世界防治结核病日：3月24日2000年我国卫生部宣布：中国处于结核病的紧急状态：（五多一缓慢）

*感染人数多44.5%的人口感染，约为5.5亿*患病人数多450万*传染源多150万*耐药病人多耐药率19%-47%，多耐药(MDRTB)*死亡人数多13万/年*疫情下降缓慢患病率年递降率为3.8%一、生物学特性形态与染色细长略带弯曲，分枝状，有荚膜，抗酸染色阳性培养特点专性需氧生长缓慢营养要求高，常用罗氏培养基生长现象液体：表面生长（菌膜）固体：颗粒、结节、花菜状菌落，乳白或米黄，不透明生化反应不发酵糖类触酶试验阳性，耐热触酶试验阴性抵抗力四不怕干燥酸（3%HCl或6%H2SO4)或碱（4%NaOH)有抵抗力碱性染料青霉素等抗生素四怕乙醇湿热紫外线抗痨药物（链霉素、异烟肼、利福平等）结核杆菌在干痰中存活6～8个月，若粘附于尘埃上，保持传染性8～10天。在3%HCl或4%NaOH溶液中能耐受30分钟，因而常以酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率。。但对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在液体中加热62～63℃15分钟，直射日光下2～3小时，75%酒精内数分钟即死亡。变异性形态结构变异：结核杆菌的L型：颗粒状、丝状、Much颗粒毒力变异：卡介苗BCG：Calmette和Guérin将牛分枝杆菌经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株耐药性变异：耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多致病物质二、致病性荚膜与细胞表面受体结合（粘附与入侵作用）保护（阻止有害物质的进入菌体）脂质索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）磷脂（形成结核结节）硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）蜡质D（引起迟发性过敏反应）蛋白质引起迟发性过敏反应所致疾病感染方式呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体所致疾病结核病，以肺结核常见肺部感染原发感染：外源性感染多发生于儿童（无免疫力）原发综合征(肺门淋巴肿大等)形成结核结节（即结核肉芽肿），少数病灶扩散，引起全身TB转归原发后感染：外或内源性感染多见成人病灶局限引起局部TB、开放性TB（反应剧烈，干酪性坏死、空洞）肺外感染进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、肾、肠、腹腔大多与结核分枝杆菌L型有关三、免疫性传染、免疫、超敏反应共存免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫属于感染免疫(infectionimmunity)，又称有菌免疫免疫与超敏反应细胞免疫为主,迟发型超敏反应同时存在郭霍现象注射结核杆菌于豚鼠皮下初次注射局部反应小全身扩散无免疫无超敏反应再次注射局部反应大不扩散有免疫有超敏反应以前感染过或免疫豚鼠正常豚鼠24-48小时10-14天局部红肿、浅溃疡局部红肿、溃疡不扩散，脱落后自行愈合坏死，经久不愈有毒TB菌全身扩散皮下郭霍现象结核菌素试验OT(oldtuberculin),PPD(purifiedproteinderivative)是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起迟发型超敏反应（Ⅳ型变态反应）的一种试验方法前臂皮内注射PPD5单位意义48～72h红肿硬结超过5mm,阳性，有免疫力,大于15mm,为强阳性阴性，无免疫力（四种情况除外：初染，严重结核，免疫力低下，老人）应用选择卡介苗接种对象和测定卡介苗接种后的免疫效果。结核菌素试验阴性者应接种或补种卡介苗在未接种卡介苗的人群中作结核杆菌感染的流行病学调查,了解人群自然感染率作为婴幼儿(尚未接种过卡介苗者)结核病的辅助诊断测定肿瘤患者的细胞免疫功能四、微生物学检查法标本处理：浓缩集菌(氢氧化钠处理）直接镜检：抗酸染色分离培养：培养基、时间（2~4周后见结果）动物试验：豚鼠等快速诊断：PCR等痰液等1、标本采集：根据结核菌感染的类型，应采取病灶部位的适当标本。

☆如肺炎结核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰）；

☆肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；

☆肠结核采取粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取脑脊液；

☆脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓液。2.1直接涂片染色:

抗酸染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”。如标本中结核杆菌量少时，直接涂片不易检出，应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。

2、涂片染色报告方法报告方法镜检结果报告方法镜检结果(－)末发现抗酸杆菌/300个油镜视野2＋1-9个抗酸杆菌/10个油镜视野(±)1-8个抗酸杆菌/300个油镜视野3＋1-9个抗酸杆菌/每个油镜视野*1＋3-9个酸杆菌/100个油镜视野4＋>10个抗酸杆菌/每个油镜视野**:必须看100个油镜视野沉淀集菌法：将标本用2%NaOH消化，37℃30min；或高压灭菌液化后，3000r/min×30min，取沉渣涂片。漂浮集菌法：将标本用生理盐水充分稀释，再加放汽油或二甲苯0.5-1ml，振荡15-30min后，吸取泡沫和油层接界部分涂片，两者均用抗酸染色，报告方法同前述。2.2集菌涂片：2.3荧光显微镜检查法:制片方法同前，用金胺O染色，镜检方法同前。3、分离培养：

标本预处理：咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂菌多，需用4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4处理30min，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物0.1ml接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。

4、动物试验:取经浓缩集菌处理的标本1.0毫升注射于豚鼠腹股沟皮下，经3～4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检；若观察6～8周后，仍未见发病者，也要剖检。剖检时应注意观察淋巴结、肝、脾、肺等脏器有无结核病变。

5、基因诊断：涂片检查需5×103-4/ml，培养需1×102/ml，标本中菌数少于此值不易被检出，PCR技术用于快速检测，少至每ml几个细菌均能检出，且速度很快，因此应用前景比较广泛。但由于实验器材的污染易出现假阳性。6、药物敏感性实验：国内外采用方法有绝对浓度法、比例法和扩散法，现在已有快速药敏试验商品化试剂销售。可见不可育菌：部分标本出现涂片阳性而培养却阴性，有称此种菌为可见不可育菌；多由于高效化疗药物的应用及机体免疫力的作用等原因形成的低活性菌或死菌。因此对每个标本都应同时进行涂片和培养检查。五、防治原则预防一般性预防：卫生宣传、提高机体抵抗力特异性预防：发现和治疗痰菌阳性者新生儿接种卡介苗治疗一般治疗：合理营养，注意休息抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平等治疗原则：早期、联合、适量、规律、分阶段治疗和坚持全程第二节

非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacteria)概念结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌对酸、碱比较敏感对常用的抗结核菌药物较耐受生长温度不如结核分枝杆菌