细菌内毒素凝胶试验法

细菌内毒素凝胶试验法第1页，课件共53页，创作于2023年2月一、试验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具等；2、确定药品细菌内毒素限值（L）；3、选择鲎试剂灵敏度（λ）；4、计算供试品最大有效稀释倍数（MVD）和最低有效浓度（MVC）；5、鲎试剂灵敏度复核；6、药品与鲎试剂相溶性的初筛试验；7、供试品干扰试验；8、干扰试验的验证；9、供试品日常的内毒素限量检查第2页，课件共53页，创作于2023年2月二、实验仪器设备

1、分析天平

2、净化工作台

3、电热恒温干燥箱（0～300℃）

4、电热恒温水浴锅（37±1℃）或干式恒温培养器

5、温度计（100±1℃

）

6、旋涡混合器第3页，课件共53页，创作于2023年2月三、实验材料和器具

1、试管架

2、镊子

3、消毒棉球

4、称量瓶(30×60mm)5、刻度吸管(1、2、5、10、15ml)6、各种试管(10×75mm)7、中号金属饭盒

8、加样器第4页，课件共53页，创作于2023年2月三、实验材料和器具

9、移液器或刻度吸管与吸耳球

10、无热原吸头

11、酒精灯

12、打火机

13、剪刀

14、砂轮

15、封口膜

16、记号笔或标记纸第5页，课件共53页，创作于2023年2月四、实验材料和器具处理凡是与供试品或反应试剂接触的器具必须经除热原处理。

1、玻璃：饮用水清净控干铬酸洗液浸泡4小时饮用水洗净洗液饮用水浸泡3次（每次30分钟）纯化水冲洗三次干燥装入饭盒250℃干烤至少1小时自然冷却至室温24小时内使用。第6页，课件共53页，创作于2023年2月四、实验材料和器具处理

1、塑料：饮用水清净控干纯化水冲洗三次干燥6%双氧水浸泡或环氧乙烷消毒密封，备用。但必须经过验证，必须无热原且不干扰细菌内毒素的检查。第7页，课件共53页，创作于2023年2月五、试剂

1、鲎试剂（TAL）：

2、细菌内毒素国家标准品（RSE）：

3、细菌内毒素工作标准品（CSE）：

4、细菌内毒素检查用水（BET水）：

5、铬酸洗液：

6、75%酒精：

7、供试品：第8页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验（一）试验程序：内毒素毒素RSE和CSEBET水复溶混匀稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液旋涡混合器混合15分钟鲎试剂TALBET水复溶混匀单次管：原安瓿多次管：反应试管轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合30秒0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSE），平行4管NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管第9页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验37℃±1℃,60±2min结果判断：反应管缓缓倒转1800阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性（-）：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者实验有效：NC管全部呈阴性（--）2.0λ管全部呈阳性（++++）0.25λ管全部呈阴性（----）数据处理：灵敏度测定值λc＝lg-1(∑X/4)X：为反应终点浓度的对数值（lg）鲎试剂灵敏度标示值λ有效：2λ≥λc≥0.5λ封口，混匀反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度第10页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验（二）试验操作基本程序：1、试剂准备：2、调节恒温水浴箱或培养器温度为37±1℃；3、制备内毒素标准溶液2λ、λ、0.5λ、0.25λ（0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml）；试剂名称生产厂家复溶体积或装量标示灵敏度或效价数量TAL×××0.5ml/支0.125EU/ml5CSE×××1.0ml/支20EU/支1BET水×××30ml/瓶1第11页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验（1）取CSE一支，用砂轮在安瓿颈上部划痕，用75%酒精棉球擦拭后，折断；（2）用刻度吸管或移液器准确吸取BET水1.0ml加入CSE安瓿内，用封口膜封口，于旋涡混合器上混合15min，即制成20EU/ml的内毒素标准溶液；（3）再将内毒素标准溶液按20EU/ml→2.0EU/ml→1.0EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.06EU/ml→0.03EU/ml步骤进行稀释；

第12页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验

1）取试管架，将7支稀释管按2.0EU/ml、1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml的顺序编号排入试管架上；

2）用刻度吸管或移液器准确吸取3.6ml、3.0ml、3.0ml、3.0ml、3.0ml、3.0ml、3.0mlBET水加入上述7支稀释管内；

3）另取一支刻度吸管或吸头，准确吸取0.8ml的20EU/ml内毒素标准溶液按，加入3.6mlBET水稀释管内，在旋涡混合器上混合30s，制成2.0EU/ml内毒素素标准液；第13页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验

4）以后每步稀释需另一支刻度吸管或吸头，准确吸取3.0ml相应浓度的内毒素标准溶液加入相应的3.0mlBET水的稀释管中，在混合器上混合30s，同法依次制备成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml的内毒素标准溶液。如下图所示。第14页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml1.0ml0.4ml3.0mlBET水CSE3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml15min30s30s30s30s30s30s20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml第15页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验

4、细菌内毒素（TAL）的准备（1）取TAL5支，用砂轮在安瓿颈部划痕，用75%的酒精棉球擦拭后，折断（避免玻璃屑落入安瓿内）；（2）用刻度吸管或移液器准确吸取BET水0.5ml沿瓶壁加入TAL的安瓿内，轻轻转动瓶壁使内容物全部溶解（避免产生气泡），将复溶后的TAL分别吸取移至一玻璃瓶内混合均匀；第16页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验（3）取试管架一个，按0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml、NC顺序做标记后，插入10×75mm反应试管，各内毒素浓度平行4管，NC平行2管；（4）用刻度吸管或移液器准确吸取TAL溶液0.1ml分别加入每支反应试管中。

5、加样：NC管各加入0.1mlBET水，其它各反应管分别各加入0.1ml相应浓度的内毒素标准溶液。如下图。第17页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验0.1mlTALCSE0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/mlNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第18页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验

6、封口：用封口膜封口，或用医用胶布在酒精灯火焰上通过1～2次后封口，轻轻混匀（避免产生气泡），将反应连同试管架放入37±1℃恒温水浴箱（或将试管直接放入反应器）中，保温60±2分钟（保温过程中应避免震动而影响凝胶的形成）。

7、结果记录：将反应管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转1800,若管内凝胶显示坚实不变形者为阳性，记录为“+”；若管内无凝胶形成，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱者，均判为阴性，记录为“-”。如下图。第19页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验++++----第20页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验阴性阳性第21页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验8、数据处理：（1）判断依据：如果最大浓度2λ的4支管均为阳性，最小浓度的0.25λ的4支管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为TAL灵敏度的的测定值（λc）。λc＝lg-1(∑X/4)X：为反应终点浓度的对数值（lg）当2.0λ≥λc≥0.5λ时，鲎试剂灵敏度标示值λ有效。第22页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验（2）反应结果：平行管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终点浓度X（反应终点浓度）0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++---0.125-0.9034++---0.125-0.903

（3）数据处理：λc＝lg-1(∑X/4)＝lg-1{[(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4]}＝0.104EU/ml第23页，课件共53页，创作于2023年2月六、鲎试剂灵敏度复核试验9、结果判断：

λc在2.0λ≥λc≥0.5λ（0.25EU/ml～0.06EU/ml）范围内，本批鲎试剂（TAL）和灵敏度标示值符合规定，应按标示值使用！第24页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验

1、供试品在进行细菌内毒素检查之前，即通过比较鲎试剂在内毒素水溶液和内毒素供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素检查有干扰。

2、如鲎试剂和供试品有以下改变，则须重新进行干扰试验：（1）鲎试剂来源改变；（2）鲎试剂的配方和生产工艺的改变；第25页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（3）供试品来源的改变；（4）供试品的配方和生产工艺的改变。3、试验程序：（1）计算：供试品细菌内毒素限值L=K/M；（2）选择：鲎试剂的灵敏度λ；（3）计算：供试品的最大有效稀释倍数MVD=L/λ或最低有效浓度MVC=λ/L=C/MVD；第26页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（4）根据初筛试验选择：供试品有效稀释倍数（≤MVD）或有效浓度（≥MVC）；（5）制备：2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素水溶液Es系列；2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素供试品溶液Et系列；（6）反应：TAL+BET水（NC）、TAL+供试品溶液（NPC）各平行2管；TAL+Es系列、TAL+Et系列各平行4管；第27页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（7）结果判断：NC管全部阴性（--），NPC管全部阴性(--)；TAL+Es系列：2λ管全部阳性（++++），0.25λ管全部阴性（----）；TAL+Et系列：2λ管全部阳性（++++），0.25λ管全部阴性（----）。试验有效。第28页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（8）数据处理：Es系列反应终点浓度几何平均值：Es=lg-1(∑Xs/4)；Et系列反应终点浓度几何平均值：Et=lg-1(∑Xs/4)；X：为反应终点浓度的对数值（lg）；供试品在该浓度下无干扰：2.0λ≥Es≥0.5λ，2.0λ≥Et≥0.5λ；若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的鲎试剂。第29页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验

4、干扰试验程序：（1）试剂准备：

（2）硫酸庆大霉素注射液细菌内毒素限值L为0.5EU/1000U。试剂名称生产厂家复溶体积或装量标示灵敏度或效价数量TAL×××0.5ml/支0.125EU/ml5CSE×××1.0ml/支20EU/支1BET水×××30ml/瓶1硫酸庆大霉素注射液×××20000U/ml1第30页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（3）硫酸庆霉素注射液：CL2000U×0.5EU/1000MVD=—

=——————————=80倍

λ0.125EU/ml或

λC20000U/mlMVC=—

=——=——————=250U/mlLMVD80第31页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验(4)制备：1）2λ、λ、0.5λ、0.25λ（0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml）内毒素水溶液Es系列（方法同鲎试剂灵敏度复核中内毒素标准溶液的制备）；2）2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素供试品溶液Et系列（用供试品稀释液代替BET水对内毒素进行稀释）。第32页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml3.6ml1.0ml0.4ml2.0mlCSE2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml15min30s30s30s30s30s30s20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml硫酸庆大霉素注射液1：40（500U/ml）的稀释液的制备（5）TAL的准备：同TAL灵敏度复核中TAL的准备。第33页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（6）加样：

1）NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管；

2）NPC：0.1mlTAL+0.1ml供试品稀释液，平行2管；

3）TAL+Es系列：0.1mlTAL+0.1ml0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml内毒素水溶液各平行4管；

4）TAL+Et系列：0.1mlTAL+0.1ml0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml内毒素供试品溶液各平行4管。第34页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（7）反应：37℃±1℃保温60±2分钟。（8）数据处理：

1）判断依据：0.1mlTALCSEBET水0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/mlNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第35页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验

0.1mlTALCSE供试品溶液0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/mlNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第36页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验如果最大浓度2λ的4支管均为阳性，最小浓度的0.25λ的4支管均为阴性，按下式计算：

Es系列反应终点浓度几平均何值：Es＝lg-1(∑Xs/4)Et系列反应终点浓度几平均何值：Et＝lg-1(∑Xt/4)X：为反应终点浓度的对数值（lg）当2.0λ≥Es≥0.5λ，2.0λ≥Es≥0.5λ时，供试品在该浓度下无干扰。第37页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验

2）反应结果：平行管数Es系列内毒素浓度（EU/ml）NC反应终点浓度X（反应终点浓度）0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--0.125-0.9034++--0.125-0.903平行管数Et系列内毒素浓度（EU/ml）NC反应终点浓度X（反应终点浓度）0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--0.125-0.9034++--0.125-0.903第38页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验3）试验有效：NC管全部阴性（--），NPC管全部阴性(--)；TAL+Es系列：2λ管全部阳性（++++），0.25λ管全部阴性（----）；TAL+Et系列：2λ管全部阳性（++++），0.25λ管全部阴性（----）。试验有效。第39页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验

4）数据处理：

Es系列反应终点浓度几何平均值：Es=lg-1(∑Xs/4)=lg-1｛[(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)]/4}=0.104EU/mlEt系列反应终点浓度几何平均值：Et=lg-1(∑Xs/4)=lg-1｛[(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)]/4}=0.104EU/ml

第40页，课件共53页，创作于2023年2月七、供试品干扰试验（9）结果判断Es和Et分别在2.0λ～0.5λ（0.25EU/ml～0.06EU/ml）范围内，供试品在该浓度下无干扰。第41页，课件共53页，创作于2023年2月八、供试品细菌内毒素检查

1、检查用反应管数量：供试品管2支；阴性对照管1支；阳性对照管1支；供试品阳性对照管1支。第42页，课件共53页，创作于2023年2月八、供试品细菌内毒素检查2、检查程序：供试品：按MVD稀释—→供试品溶液；内毒素：BET水复溶—→稀释为2λ内毒素水溶液；供试品溶液复溶—→稀释为2λ内毒素的供试品溶液；鲎试剂：BET复溶—→原安瓿或反应管。第43页，课件共53页，创作于2023年2月八、供试品细菌内毒素检查

3、检查加样：供试品管NCPCPPC

加样0.1mlTAL0.1ml供试液0.1mlBET水0.1ml2λ内毒素水溶液0.1ml2λ内毒素供试品溶液平行管数2111

封口、混合、孵育反应条件

37℃±1℃保温60±2分钟

结果判断符合规定---++不符合规定++-++需要复测+--++复测符合规定-----++复测不符合规定+----++试验无效+++试验无效--+试验无效-+-第44页，课件共53页，创作于2023年2月八、供试品细菌内毒素检查

4、样品检查：（1）硫酸庆大霉素注射液细菌内毒素限值L为0.5EU/1000U。（2）根据干扰试验结果，可选择灵敏度为0.125EU/ml的TAL对硫酸庆大霉素注射液按最大有效稀释倍数进行日常检查。第45页，课件共53页，创作于2023年2月八、供试品细菌内毒素检查（3）硫酸庆霉素注射液：CL2000U×0.5EU/1000MVD=—

=——————————=80倍

λ0.125EU/ml或

λC20000U/mlMVC=—

=——=——————=250U/mlLMVD80第46页，课件共53页，创作于2023年2月