第8章-标记-课件

第八章标记

MethodsofLabelling

2023/7/27海南大学农学院wss1概念标记：以共价键的方式将某些元素或化学基团（标记物）结合到生物分子中，成为示踪复合物（探针），通过一定的方法显示其存在的部位。探针：带有标记物的、感兴趣的生物大分子或小分子，当它们与相应的物质反应时（杂交），筛选得到确定的信息资料。标记物：放射性同位素、化学发光物、生色基团、荧光物等。2023/7/272内容提要第一节 核酸标记第二节 蛋白质（酶、抗体）标记2023/7/273第一节核酸标记（制备探针）核酸探针（probe）：能与特定核酸序列（靶序列）发生特异性互补（核酸）杂交，并含示踪物的已知核酸片段(DNA或RNA)。因而可检测样品中特定的基因序列。2023/7/274根据核酸探针的来源及性质有双链DNA、单链DNA、单链RNA和人工合成的寡核苷酸探针等。用于分子杂交的核酸探针均须进行标记，带有示踪物，与靶基因杂交后，才能检测显示出杂交体信号。标记物有放射性同位素和非放射性同位素两大类。3H、35S和32P是三种较常用的放射性同位素标记物，非放射性同位素标记物较常用的是生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin，DIG）和荧光素等。

2023/7/275探针所携带的标记物应具备的条件：1.标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。2.标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。3.稳定性好、环境污染少、价廉。2023/7/276一、标记物的制备及类型以标记物分类：放射性同位素标记（3H,14C,32P,35S,125I）非放射性同位素标记（地高辛、生物素、酶、荧光素）以制备方法分类：双链DNA探针标记法；单链DNA探针标记法；PCR合成DNA探针；寡聚核苷酸探针；RNA探针。2023/7/277标记方法掺入法:即在DNA、RNA合成时，标记物携带在单核苷酸上，作为合成的原料形式直接掺入进去。方法分类：1.随机引物法2.切口平移法3.cDNA合成法4.PCR法5.3’，5’末端寡聚核苷酸6.3’加poly(A)尾等方法。2023/7/2782023/7/279二、非核素标记非放射性核素标记都很容易掺入到DNA或RNA中制成核酸探针。使用的非放射性物质主要是生物素、地高辛、荧光素。检测方法主要有三种：化学发光法、生色法、荧光法。2023/7/27101.地高辛（digoxigeninDIG）是一种类固醇物质，来源于洋地黄类植物。2023/7/2711DIG标记是德国BoehringerMannheim公司发展的一种非放射性标记方法。Digoxigenin-11dUTP可以通过随机引物标记结合到DNA探针或通过DNA体外转录标记到RNA探针，或通过3′-尾端标记结合到寡聚核苷酸探针。然后与抗地高辛抗体（anti-digoxigeninalkalinephosphatase）进行免疫反应，通过化学呈色检测。2023/7/2712技术特点：与放射性标记相比较，DIG系统具有以下多个优势：高灵敏度曝光时间短安全环保探针可重复使用可轻松进行探针拨离和重探2023/7/27132.生物素将生物素（Biotin）连接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）进行检测。酶一底物颜色反应检测：亲和素可以用酶（过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、荧光素或高电子密度（铁蛋白、胶体金等）的标志物标记。生物素标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便。

2023/7/27142023/7/27153.分子信标（分子灯塔探针）2023/7/2716三、核素标记（一）核酸探针传统的标记物是用放射性同位素，多用32PdNTP、3HdNTP

、35SdNTP等。用放射性同位素标记核酸有以下优点：1.灵敏性高2.特异性高

3.方法简便2023/7/2717（二）放射性同位素标记技术也存在以下缺点：1.半衰期短，必须经常标记探针2.费用高3.检测时间长4.放射性同位素对人体有害2023/7/27181.32P2.33P比32P使用安全。3.含35S的前体标记物NTP或dNTP是借助以取代与磷酸共价相连的氧原子制成的。4.3H标记的探针常用于原位杂交和核酸的合成和降解分析，与32P、35S、125I等比较，它的能量最低。（三）几种常用放射性同位素比较2023/7/2719常用放射性核素的物理性质核素半衰期100%纯度时核素放射性活性(Specificactivity)(Ci/mmol)放射粒子的最大能量Emax(KeV)

3H12.4年

2918.5－14C5100年

62156－32P14.3天

91201710－35S87.1天

1490169－

125I60天

240034.634.5131I8.6天

161006083652023/7/2720

1.32P标记在NTP或dNTP的磷酸位上。用放射自显影或磷酸图像仪检测。Nucleotidelabeling2023/7/272132Por33P可取代dNTP或NTP不同磷酸位上的P原子，35S可取代核酸中磷酸分子上的一个O原子，3H取代H原子。dCMP2023/7/2722PdCMPSdCMPH2023/7/2723四、常用的探针标记法1.双链DNA探针标记（1）随机引物介导法（2）切口平移法2.单链DNA探针制备3.PCR合成DNA探针4.寡核苷酸探针的制备5.RNA探针的制备2023/7/27241.双链DNA探针标记

（1）随机引物介导法随机引物是6～12个核苷酸单链（来源于某种生物组织细胞的DNA降解小片段或人工合成的）。随机引物与线性DNA模板杂交，在DNA聚合酶的催化下，从引物的3′末端开始按5′→3′方向合成与模板DNA互补的DNA链，如有[α-32P]dNTP或其他标记物的掺入，就可产生标记的DNA探针。见P182图2023/7/2725

变性DNA加入随机引物混合物(六核苷酸)和dNTP标记混合物加入Klenow

片断(无核酸外切酶活性)2023/7/2726Labellingprobesby“randompriming”DNA片断热变性5’5’3’3’加入随机引物六核苷酸所有随机组合有4096种2023/7/27275’3’5’3’3’3’5’5’加入DNA聚合酶dNTPs

其中一个是标记的dNTP2023/7/2728[32P]dATP

通常用作放射性标记的探针。放射自显影检测。地高辛(DIG)-dUTP通常用作非放射性标记的探针。用酶联抗地高辛抗体检测。变性2023/7/2729[32P]dATP通常用作放射性标记的探针。放射自显影检测b-particlesblackenX-rayfilmDNA固定在杂交膜上2023/7/27302023/7/2731（2）切口平移法（NickTranslation）原理及过程：当双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶I可把核苷酸残基加到切口处的3’羟基端。由于该酶具有5’→3’外切核酸酶活性，所以它可从切口的5’端除去核苷酸。5’端除去与3’端加入核苷酸同时进行，导致切口沿着DNA模板链移动。随着反应的进行，底物中被标记的单核苷酸被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。2023/7/2732

切口转移2023/7/27332023/7/27342.单链DNA探针制备用DNA模板制备单链DNA探针的方法有：（1）合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌体载体上的DNA为模板，合成与其序列互补的探针；需要分离探针与未标记的核酸。（2）将克隆于特定载体上靶序列转录成RNA的探针。用不含有RNA酶的DNA酶Ⅰ极易除去模板DNA。2023/7/27352023/7/27363.PCR合成DNA探针在PCR循环过程，TagDNA聚合酶可将标记的dNTP掺入DNA链中，用此法制备的探针灵敏度高，数量大。2023/7/2737PCR合成DNA探针Labelinginapolymerasechainreaction在PCR反应里有用DIG-或32P-标记了的dNTP:2023/7/27384.寡核苷酸探针的制备1）3’端寡核苷酸探针2）3’端尾部寡核苷酸探针3）5’端寡核苷酸探针2023/7/2739(a)

5´-pNpNp………NpNpN-OH-3´ DNAorRNAddA-p*-p-p

a-b-g末端转移酶+α-32P-ddATP5´-pNpNpNpNp………Np

(a)

NpA-pA—pA－－H-3´3´-末端标记（3´-

endlabelling）

(a)单链(DNAorRNA)标记用末端转移酶2023/7/27402023/7/27413´-末端标记

(b)双链DNA用DNA聚合酶2023/7/27425´-N………GGATCC……..N-3´ DNA3´-N………CCTAGG……..N-5´dA-p*-p-p

a-b-gDNA聚合酶+a-32P-dATP+dCTP,dGTP,dTTP5´-N………G-3´5´-GATCC……..N-3´3´-N………CCTAG-5´3´-G……..N-5´5´-N………GGATCGATCC……..N-3´3´-N………CCTAGCTAGG……..N-5´用BamHI

限制性内切酶消化REDNA片断3´-末端被标记2023/7/27432023/7/27445´-末端标记（5´-

endlabelling）是一个两步反应;适用于RNA和双链或单链DNA;碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶和

g-32P-ATP;DNA5′末端的磷酸根，用碱性磷酸酶去磷酸化，再用T4多核苷酸激酶将[γ-32P]ATP的γ-32P转移到DNA5′端的羟基上。2023/7/27455´-末端标记5´-pNpNpNpNp………3´ DNAorRNA5´-*pNpNpNpNp………3´+A-p-p(ADP)T4多核苷酸激酶+g-32P-ATP碱性磷酸酶(egCIP)5´-NpNpNpNp………3´2023/7/27465.RNA探针的制备

体外转录对RNA的均匀标记add

T7RNApolymerase

andNTPs

withone

a-32P-labelled先克隆合适的模板DNA到相应的转录载体linearise

vectorinMCSdownstreamofinsertRNAmoleculeslinearDNAT7T32023/7/2747体外转录法2023/7/2748内容提要第一节 核酸标记第二节 蛋白质（酶、抗体）标记2023/7/2749第二节蛋白质标记抗体-抗原，酶-底物，激素-受体蛋白等特异性的反应无法直观表现与判断，只有借助发色、发光试剂；或者同位素、酶试剂标记产生高度专一性的探针，利用其作为靶标，又能发出检测信号的特点，提供判断依据。2023/7/2750一、标记方法1.酶标记法2.荧光染料标记3.生物素标记4.金标记5.同位素标记2023/7/27511.酶标记抗体IgG辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β－半乳糖苷酶与双功能试剂戊二醛偶联到抗体分子IgG，制成特异性探针。标记物：酶2023/7/27522023/7/27532.荧光素染料标记抗体荧光素、罗丹明、德克萨斯红及异硫氰酸荧光素等物质在碱性条件下与抗体分子IgG发生偶联反应，根据荧光素特异波长及抗体蛋白波长之比值判断其结合量。CyDye荧光染料直接标记第二抗体，不需要反应底物，直接扫描进行筛选；或直接掺入DNA，可进行核酸标记。2023/7/27543.生物素标记抗体2023/7/2755蛋白A-金颗粒复合物蛋白A-－直接结合到胶体金上，与免疫球蛋白有极高的亲和作用。蛋白A金颗粒4.金标记抗体2023/7/2756免疫胶体金的性质免疫胶体金的反应机制：胶体金是一种由极小的金颗粒组成的、带负电荷的、疏水性的胶状体。常用的是5～30nm。胶体金性能稳定、对细胞无毒性、金颗粒形状规则、电子密度高、便于观察和分析。胶体金的金颗粒的直径规格不同，所以能选择差别较大的2～3种，对同一细胞中的不同种抗原进行双重或三重标记，以便进行抗原的定性和定位的比较研究。胶体金颗粒小，能提高标记的准确性，且容易渗透到细胞质里，甚至细胞质中的一些细胞器里。2023/7/2757免疫胶体金反应机制胶体金与一抗(直接法)或二抗(间接法)结合，生成免疫抗体或抗抗体复合物，再与细胞中相应的抗原发生特异性免疫反应，形成抗原与胶体金标记的抗体或抗抗体复合物。利用金颗粒的电子密度高，电镜下检测到的金颗粒存在的部位，即是所探求的抗原在细胞中的定位。另外通过分析金颗粒的相对密度的高低，还能进行半定量的研究。2023/7/2758免疫胶体金反应2023/7/2759二、标记物的纯化萃取－沉淀（有机溶剂的选择性沉淀）层析法（凝胶过滤、离子交换、吸附、亲和层析）离心分离电泳分离2023/7/2760三、探针的鉴定杂交法酸沉淀法层析法比色法发光法电子显微镜观察2023/7/2761放射性同位素标记探针：放射自显影。非放射性物质标记探针：偶联反应+显色反应。2023/7/27622023/7/27631.杂交法

此法通常是由印迹、杂交和检测分析等步骤组成。分子杂交：标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。

分子杂交包括：DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。

分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。2023/7/2764Southernblot

1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。

原理和步骤:

提取DNA

限制酶消化DNA片段电泳分离变性转移至尼龙膜变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析2023/7/27652023/7/2766斑点杂交(dotandslothybridization)

鉴定核酸序列的简便方法。原理及步骤：提取CellDNA

↓

点样品至膜、干燥、固定

↓

探针、DNA变性、杂交

↓

洗膜、放射自显影

↓

结果分析

2023/7/2767Northernblot

是指RNA印迹法，应用特异性基因探针分析基因的转录水平。原理及步骤：提取Cell总RNA↓

提纯分离mRNA

↓

琼脂糖凝胶电泳分离RNA↓

转移至硝酸纤维素膜

↓

杂交检测2023/7/2768Western

杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗