野生虫草与人工虫草蛋白质差异研究

野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白组差异研究王艺璇摘

要冬虫夏草Ophiocordycepssinensis是麦角菌科冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。具有“补肾益肺，止咳化痰”之功效，是一种名贵中药。由于其生理生化的特殊性和复杂性，目前其子实体形成机制研究得并不明确。本研究利用Illumina/SolexaHiSeq2500反转录测序技术对冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组进行测序、数据组装、分析，发现冬虫夏草菌丝体、子实体与冬虫夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼虫与其他样品的同源性很低；差异表达分析发现9238个基因在冬虫夏草菌丝体、子实体中均有表达，这相当于

72.57％的重合度；经鉴定，1003个基因为DEGs（差异表达基因），KEGG富集分析显示这些DEGs富含核糖体途径；有161个差异表达基因参与丰富了GO

术语。子实体中有58个差异表达基因下调，103个差异表达基因上调，表明冬虫夏草蛋白质合成的基本代谢在冬虫夏草菌感染小金蝠蛾幼虫后发生了改变，以及47个基因特异表达；还发现肌动蛋白和微管蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。这些结果均与冬虫夏草子实体形成相关。同时利用2-DE（双向电泳）技术对冬虫夏草的发育过程中的三个阶段（菌虫复合体、子座、整体）的蛋白质组进行分析，筛选出5个稳定存在的蛋白质和3个具有显著差异的蛋白质，这8种蛋白质均在子座形成后出现。通过质谱技术进一步鉴定了这8个蛋白质，对其进行功能注释分析(GO、KEGG)后发现，3个具有显著差异的蛋白质斑点1、斑点5、斑点6均与细胞构成相关，其中斑点1参与大量核苷酸结合和酶活性过程，斑点5参与了大量代谢过程和化合物结合过程，斑点6参与了大量代谢过程和细胞生长过程；5个稳定存在的蛋白质中斑点2、斑点3与刺激应答、核苷三磷酸酶结合相关，斑点4与有机氮化合物代谢、离子结合相关，斑点7与生物调节和水解酶活性相关，斑点8与物质运输和转录合成相关。斑点1鉴定为肌动蛋白，GO注释发现该蛋白大量参与了细胞、细胞区域、细胞组分、细胞内、细胞内部分等过程，KEGG通路富集分析发现其活跃的代谢途径为磷脂酰肌醇信号系统、吞噬小体，提示肌动蛋白可能在冬虫夏草的生长发育中其重要作用。1还通过2-DE（双向电泳）技术对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座的蛋白质组进行对比分析，筛选出野生冬虫夏草特有的蛋白质，验证了课题组前期冬虫夏草正伪品指标性蛋白质，并基于蛋白质层面揭示了野生冬虫夏草与人工培育冬虫夏草间的差异，为后续野生冬虫夏草与人工冬虫夏草的鉴别研究奠定了基础。关键词：冬虫夏草；转录组；蛋白组；指标性蛋白质；发育前言冬虫夏草Ophiocordycepssinensis为麦角菌科真菌侵染蝙蝠蛾科多种幼虫后

形成的菌虫复合体，是我国传统名贵中药[1]。具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗

氧化、抗衰老、降血糖血脂等广泛的药理作用，与人参、鹿茸并称“三大补药”[2,3,4]。中国是冬虫夏草最主要的分布地，占全球冬虫夏草分布面积的90%以上，

主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肃等省3000~5200m的高海拔地区[5,6,7]。近年来由于全球气候变暖和青藏高原生态环境的变化，冬虫夏草的野生资源日趋

减少。同时由于冬虫夏草特殊的药理作用，使其在药用、保健等方面的用量日益

增加，国内外市场需求量日渐攀升高，冬虫夏草的人工培育成为研究热点[8]。目

前对冬虫夏草人工培育的研究主要集中真菌分离、幼虫繁殖、侵染三个阶段，相

对比较成熟，但主要问题在于侵染后子座形成率低，这是困扰冬虫夏草人工培育

的技术关键[9,10,11]，由于冬虫夏草生长环境特殊、周期长，关于冬虫夏草形成机

制的关键阶段——子实体形成的研究较少，至今未有明确报道，亟待利用新方法

进行研究，为后续野生抚育、人工培育提供科学依据。同时目前市场有一定量的人工冬虫夏草以野生冬虫夏草形式流通，二者生长周期差异较大，外观相似度高，课题组前期发现其成分差异较大，缺乏必要的鉴别手段，亟待寻找鉴别点，建立新的鉴别方法。在生物学研究中以表征全部基因的表达情况为目的的研究被称为转录组表达谱研究，相应的以表征全部蛋白质表达情况为目的的研究被称为蛋白质组表达谱研究[12]。生物在遭受某种刺激或病变时往往会伴随着某些基因或蛋白质表达量的变化，其中有些变化是引起生物体变化的原因，有些则是生物体变化的结果[13]。在生物系统中，基因组是遗传信息的储存体，mRNA（转录组）是基因表达的中间体，功能性蛋白质（蛋白质组）是基因功能的执行体[14]。因此基因组和转录组之间理所当然的存在不对应关系，而mRNA和蛋白质则是基因表达中两个不同阶段产物。为了深入研究冬虫夏草的生长发育过程，挖掘与冬虫夏草的形成、功效相关的物质，本研究将冬虫夏草转录组与蛋白质组相结合，旨在发现冬虫夏草转录组与蛋白质组之间的相关性，为研究冬虫夏草的生长发育过程提供资料。第二代转录组测序技术主要分别为罗氏454焦磷酸测序技术[15]、Illumina/Solexa

聚合酶合成测序[16]以及ABI/SOLiD

连接酶测序技术[17]三种。而Illumina/Solexa

测序技术具有测序通量大，测序质量高的优势。本研究采用Illumina/SolexaHiSeq2500高通量测序平台对冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组进行测序分析，通过数据库与冬虫夏草转录组序列进行对，预测与冬虫夏草生长发育相关基因。本课题组前期已经利用蛋白质严格的种属特异性和组织特异性，与不同品种间在凝胶图谱中具有差异蛋白谱带的特点，采用双向电泳技术(2-DE)分离冬虫夏草蛋白，获得冬虫夏草正伪品电泳图谱，得到88个冬虫夏草共有蛋白质，筛选了26个差异蛋白斑点作为冬虫夏草指标性蛋白质，可定性鉴别冬虫夏草[18]。本课题在此基础上，通过对比分析野生冬虫夏草发育过程中的三个阶段（菌虫复合体、子座、整体）蛋白质图谱，筛选出发育过程中稳定存在的蛋白质和具有显著差异的蛋白质，并结合LC-MS/MS和数据库搜索对其进行生物功能分析，同时验证了前期冬虫夏草指标性蛋白质。对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座的蛋白质组进行分析，筛选出野生冬虫夏草及人工冬虫夏草差异性蛋白质，验证前期冬虫夏草指标性蛋白质并在蛋白质层面揭示了野生冬虫夏草与人工培育冬虫夏草的差异，为后续研究奠定基础。研究内容2.1冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组分析2.2冬虫夏草各个发育阶段蛋白质组分析2.3冬虫夏草发育阶段差异蛋白质的鉴定与分析2.4

野生冬虫夏草、人工冬虫夏草蛋白质组分析技术路线：转录组技术路线图：蛋白质组技术路线图：差异蛋白质寻找技术路线：3.4.2人工冬虫夏草子座、人工冬虫夏草菌虫复合体、人工冬虫夏草差异蛋白第一章冬虫夏草转录组分析转录组是指特定生物体在某种状态下所有基因转录产物的总和，转录组研究属于功能基因组学研究的范畴，是连接基因组与蛋白质组的纽带。转录组研究着重于功能基因的表达，阐述生物学过程中的分子机理[19]。西洋参P.quinquefolius[20]是目前应用最广泛的传统中药材之一，也是较早开展转录组研究的中药材。西洋参转录组的研究采用了454GSFLXTMTita-niumSystem

平台，得到了209747条高质量序列，平均读长427个碱基，数据组装得到16592

条contig和14496

singleton。通过Nr库注释，得到21684个基因。通过KEGG通路注释，发现西洋参的转录组中包含了甾醇骨架合成通路、油菜素类固醇合成通路和豆甾醇合成通路的所有基因。本部分研究通过二代转录测序技术Illumina/SolexaHiSeq2500测序技术获得冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组序列，对所得序列进行Unigene

功能注释、GO分类和差异表达分析，运用序列对比程序对冬虫夏草菌丝体、子实体、小金蝠蛾幼虫及冬虫夏草进行两两比较，发现冬虫夏草菌丝体、子实体和冬虫夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼虫与其他样品的同源性很低；在对161

个差异表达基因GO分析后发现，子实体中有58个基因下调，另外103个基因上调，表明在冬虫夏草菌感染小金蝠蛾幼虫后冬虫夏草蛋白质合成的基本代谢发生了改变，同时发现肌动蛋白基因MSTRG.3317的表达水平在冬虫夏草中下调，微管蛋白相关基因MSTRG.3823，MSTRG.6894的表达水平均在子实体中上调，表明肌动蛋白和微管蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。这些结果均与冬虫夏草的发育相关，为冬虫夏草的发育研究提供了资料。1仪器与材料1.1仪器立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-75SII)、电热鼓风干燥箱(GZX-9240MBE)均购自上海博讯实业有限公司。T100TM(ThermalCycler)、凝胶成像系统购自BIO-RAD；高速冷冻离心机(ST16R)、超低温冰箱905、紫外分光光度计(NanoDrop2000)购自ThermoFisherScientific；优普系列超纯水器(UPH-II-10)购自成都超纯科技有限公司；HiSeq2500测序仪(IMS-20，Illumina/Solexa)、超净工作台（SW-CJ-2D,

苏净安泰）1.2试剂PureLink®PlantRNAReagent(Ambion,

美国)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，TransStartFastPruFlyDNAPolymerase(全式金，北京)，Trans2KPlusDNAMarker

（全式金，北京），RTreagentKitwithgDNAEraser（Takara,

日本），转录组高通量测序由北京百迈克生物技术有限公司完成。1.3样品冬虫夏草菌丝体Hirsutellahepiali

、新鲜冬虫夏草子实体Ophiocordycepssinensis、小金蝠蛾幼虫Hepialusxiaojinensis经成都中医药大学国锦琳教授鉴定分别为冬虫夏草菌丝体、新鲜冬虫夏草子实体、小金蝠蛾幼虫。样品备份于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。2方法2.1人工冬虫夏子实体、菌丝体、小金蝠蛾幼虫RNA提取2.1.1冬虫夏草子实体、菌丝体RNA的提取（按PureLink®PlantRNAReagent试剂盒说明书操作）取100mg新鲜样品在液氮中充分研磨（研磨要迅速，最好不要超过1min），加入0.5m预冷PureLink®植物RNA试剂，涡旋混合或轻弹试管底部，至样品

充分重悬。室温孵育5min。室温离心，12000×g，2min，转移上清液至无RNA

酶的1.5mLEP管。向提取物中加入0.1mL5MNaCl，轻轻混匀。再加入0.3mL

三氯甲烷，颠倒试管混匀。4℃离心，12000×g，10min，将上层水相转移至无

RNA酶的1.5mLEP管中。向水相中加入等体积的异丙醇，混合均匀，并在室

温下静置10min。再次离心10min。弃上清液，向沉淀中加入1mL75%乙醇。

室温离心，12000×g，1min，弃上清液，小心不要丢失沉淀，短暂离心收集残余

液体，并用移液管取出。RNA沉淀中加入10～30LRNase-Free水，反复吹打

以重悬RNA，如果观察到任何浑浊，将溶液在室温下以12000×g离心1min，并

将含有RNA的上清液转移至无RNA酶的1.5mLEP管中，将纯化的RNA储存

在-70

℃。2.1.2小金蝠蛾幼虫RNA的提取（按Trizol试剂盒说明书操作）2取25-30mg小金蝠蛾幼虫样品放于匀浆器中，加入液氮研磨，然后加入1mL

Trizol试剂匀浆，至无明显组织碎片，将匀浆液转入EP管中。4℃,12000×g离心15min，将上清液转入新的EP管中。上清液15-30℃温育5min后加入0.2mL

氯仿，用力摇匀15s左右，于15-30℃温育5min。再次离心20min(4℃,12000×g)，用移液枪小心将上层水相转移到新EP管中（枪头勿吸入沉淀），加入0.5mL

异丙醇轻轻混匀，沉淀RNA，15-30℃温育10min。离心10min(4℃,12000×g)，弃上清，用1mL75％乙醇清洗2次。涡旋振荡样品，4℃，7500×g离心5min。于超净工作台内干燥8min左右，加30μLRNase-free水，用枪头吸打混匀，55℃温育10min，-70℃贮存备用。2.2冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组测序及分析2.2.1转录组测序提取冬虫夏草菌丝体(HH-1、HH-2)、子实体(CS-1、CS-2)、小金蝠蛾幼虫(HX-1，HX-2)总RNA，用Agilent2100Bioanalyzer

检测RNA提取质量，建好测序文库，用IlluminaHiSeq2500

进行测序，不同样品分别做2个平行，以消除个体误差。2.2.2短读序组装用短读序组装程序Trinity对冬虫夏草菌丝体、子实体、及冬虫夏草的cleanreads进行从头组装，利用Nr，Swiss-Prot，KEGG和COG数据库和软件ESTScan预测基因蛋白质编码区[21]，并决定其序列方向，并将得到的原始图像数据经basecalling

转化为序列数据，称为原始读序，以fastq

格式储存，提交到NCBI

序列读取存档。2.2.3测序质量评估以FastQC软件评估6个样本的测序Read质量、GC含量等，发现6个样本RNA-Seq质量较高，可用于进一步的denovo组装、功能注释及差异表达基因挖掘等分析。2.2.4Unigene功能注释、GO分类分析用Blastx

将Unigene

序列到蛋白数据库Nr，Swiss-Prot,

KEGG

和KOG(E3码序列及gDNA序列，用Sanger

测序技术对所克隆基因重测序，并将其与转录组组装序列做Blast比对分析，以确定所克隆序列的正确性。依据现有研究成果挖掘相关基因及差异分析。将转录组测序得到的实验结果利用real-timePCR进行验证。3结果与讨论3.1转录组测序以FastQC软件评估6个样本的测序Read质量、GC含量等，发现6个样本RNA-Seq质量较高，可用于进一步的GO功能注释分析、差异表达基因分析等研究。去除掉质量差的后，分别从冬虫夏草菌丝体、子实体及小金蝠蛾幼虫中得到了约125bp长的72898546，69048056和62543256条cleanreads。3.2短读序组装检

索

了

保

存

在

The

Sequence

Read

Archive(SRA,

http://

/Traces/sra/sra.cgi？)

中的冬虫夏草O.sinensis（命名为SRR）的RNA-Seq读段并从冬虫夏草菌丝体、子实体、冬虫夏草的cleanreads

中筛选了22524、26534和30132个unigenes。运用序列对比程序对冬虫夏草菌丝体、子实体、小金蝠蛾幼虫及冬虫夏草进行两两比较，发现冬虫夏草菌丝体、子实体和冬虫夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼虫与其他样品的同源性很低。用短读序组装程序Trinity对冬虫夏草菌丝体、子实体及冬虫夏草的cleanreads进行从头组装，总共有34152个unigenes(

≥200bp)被组装。为了全面表征不同RNA-Seq样品的表达模式，检查个体转录组是如何相关的，通过主成分分析(PCA)进一步分析34152个unigenes的全局表达模式。结果显示冬虫夏草菌丝体/冬虫夏草/子实体组与小金蝠蛾幼虫组之间有明确的分离，生物学上具有良好的重复性（图1A），与BLAT结果一致。表明冬虫夏草的子实体可能具有与菌丝体相似的转录组。4图1.从冬虫夏草菌丝体和子实体获取的四个样本的KOG分类和表达分析A：装配基因的KOG分类;B：六个样品RNA-Seq的主成分分析;C：表达转录本的维恩图。Figure.1.KOGclassificationandexpressionanalysisoffoursamplesfrommyceliumandFruitingbodyofOphiocordycepssinensis.A:KOGclassificationofassemblygenes;B:principalcomponentanalysisofRNA-seqinsixsamples;C:Venndiagramexpressingtranscripts.3.3差异表达和功能富集分析将冬虫夏草菌丝体组和子实体组的所有RNA-SeqPE读数分别与O.sinensis

CO18(/assembly/GCA_000448365.1/)的基因组序列比对，并由StringTie组装。总共组装了11264个基因组编码基因和233个新基因。为了全面表征不同样品RNA-Seq的表达模式，将每个基因的比对读数的数量标准化，结果发现，9238个基因在冬虫夏草菌丝体、子实体、小金蝠蛾幼虫及冬虫夏草中均有表达，这相当于72.57％的重合度（图1B）。经鉴定，1003个基因为DEGs。KEGG富集分析显示这些DEGs富含核糖体途径。背景转录组中共有33个基因参与了该途径，其中24个基因在子实体和菌丝体组之间差异表达。GO富集也证实了这一结果。DEGs的主要GO术语包括大分子复合物（102个基因），有机物质生物合成过程（88个基因），生物合成过程（88个基因），细胞生物合成过程（81个基因）和有机氮化合物代谢过程（81个基因），见图2。DEGs的富集分析发现剧烈变化的基因主要富集在核糖体的结构成分、核糖体亚基、蛋白酶体核心复合体、MCM复合体、核糖核蛋白复合体途径。有161个差异表达基因参与丰富了GO术语。子实体中有58个基因下调，另外103个基因上调。这些结果表明，冬虫夏草蛋白质合成的基本代谢在冬虫夏草菌感染小金蝠蛾幼虫后发生改变。分析发现冬虫夏草中还有47个基因特异表达（特异表达基因，SEG），包括非核糖体肽合成酶，细胞色素P450，HSP70家族伴侣，乙醛酸酶家族蛋白，细胞壁相关蛋白，乙醛酸酶家族蛋白和推定的琥珀酰-CoA连接酶编码基因。GO分类结果表明，有8个特异表达基因与细胞部分相关。并且有62个基因在菌丝体中特异性表达，包括膜联蛋白，核糖体RNA加工蛋白12编码基因。图2差异表达转录本的GO分类Figure2.GOclassificationofdifferentiallyexpressedtranscripts3.4子实体发育涉及基因子实体发育是一个由多基因控制的复杂的细胞分化过程。实验发现与菌丝体（HH-1和HH-2）相比，冬虫夏草子实体（CS-1和CS-2）中有一些特征性的子实体发育相关基因表达上调。Ndk-1和sod-1基因在光形态发生的某些方面起着至关重要的作用。Ndk-1编码一个核苷二磷酸激酶，参与了生物体中的光信号转导通路。MSTRG.2107编码核苷二磷酸激酶，冬虫夏草子实体样品的表达水平显著高于HH。Sod-1编码超氧化物歧化酶。MSTRG.2218，MSTRG.5467，MSTRG.5954和MSTRG.69514在内的4个sod-1基因在子实体和菌丝体中的表达均有明显变化。表达最高的sod-1基因MSTRG.5954在冬虫夏草子实体中表达水平为1608.88，而在菌丝体中表达水平为198.95，下降了8.09倍。MSTRG.5094和MSTRG.5858编码异源三聚体G蛋白的β亚基子实体样本中这两个基因的表达也高于菌丝体样本。Nrc-2，vma-1，cel-2和car1是一些涉及形成子囊壳，初生孢子囊或子囊孢子的关键基因。子实体样本中这些基因的表达水平也高于菌丝体样本。根据GO注释，MSTRG.8670和MSTRG.16参与有性生殖和主要性特征的发展途径。子实体中这两个基因表达丰度均上调。李翔等[22]发现了121个可能参与子实体发育的候选基因。我们鉴定了81个与这121个候选基因具有高度序列同一性(95％)的基因（图3）。在81个基因中，有25个基因在log2FC≥1时表现出明显的表达变化，但只有12个基因发生log2FC≤-1变化。图3子实体发育候选基因的表达模式。根据HemI工具包的log2FC值绘制热图。根据每个基因的表达水平计算CS样品组和HH样品组之间的Log2FC。3.5肌动蛋白和微管蛋白相关基因肌动蛋白基因(MSTRG.3317)的表达水平在冬虫夏草中下调。子实体样本组平均表达丰度为45.25，菌丝体组平均表达丰度为155.24。冬虫夏草中存在2个微管蛋白/FtsZ蛋白编码基因(MSTRG.3823，MSTRG.6894)。MSTRG.3823为微管蛋白/FtsZ家族蛋白(EQL01373.1)编码序列。子实体和菌丝体样本组中基因的平均表达水平分别为1748.13和574.04。MSTRG.6894为微管蛋白FtsZ基因。该基因表达从菌丝体组的27.18上调至子实体组的78.95。表明，肌动蛋白和微管蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。4小结对人工培育的冬虫夏草子实体及菌丝体、小金蝠蛾幼虫进行高通量的测序，验证发现测序结果良好。对转录组数据比对到已知的冬虫夏草基因组上，比对结果良好。表明冬虫夏草菌丝体、子实体和冬虫夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼虫与其他样品的同源性很低。鉴定在冬虫夏草菌丝体、子实体、小金蝠蛾幼虫及冬虫夏草中均有表达的差异表达基因，进行GO，KEGG分析发现这些基因活跃的细胞活动或是通路。深入分析子实体时期的差异表达基因。发现与菌丝体相比，冬虫夏草子实体中有一些特征性的子实体发育相关基因表达上调。4个sod-1基因MSTRG.2218，MSTRG.5467，MSTRG.5954和MSTRG.69514在子实体和菌丝体中的表达均有明显变化。表达最高的sod-1基因MSTRG.5954在菌丝体中表达水平比在冬虫夏草子实体中表达水平下降了8.09倍。根据GO注释，MSTRG.8670和MSTRG.16均参与了有性生殖和主要性特征的发展途径。而子实体中这两个基因表达丰度均有上调。肌动蛋白基因(MSTRG.3317)的表达水平在冬虫夏草中下调，微管蛋白相关基因(MSTRG.3823,MSTRG.6894)的表达水平均在子实体中上调，表明，肌动蛋白和微管蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。为冬虫夏草的发育研宄提供数据支持。第二章冬虫夏草不同发育阶段蛋白组分析20世纪90年代澳大利亚学者MarcWilkins与KeithWilliams首先提出蛋白质组学的概念[23]。其研究的基本对象即蛋白质——能囊括一个细胞乃至整个生物体所表达的全部蛋白质。而差异蛋白质组学是对某个体系的蛋白质进行鉴定，并详细阐述其翻译后修饰的特性差异的蛋白质组学，即以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理和病理体系或过程的蛋白质表达的比较，通过各种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白质作用的网络图谱[24]。在疾病的早期诊断、病程及疗效监测、环境因素影响分析等方面的应用价值是不言而喻的。Petricoin等[25]应用C16芯片对卵巢癌患者和正常对照者血清中进行研究，结果发现在质荷比值为534、989、2111、2251和2465处5个峰的同时变化对于诊断具有重要意义，进行簇分(clusteranalysis)，建立了一种簇分模型(cluster

pattern，能有效地筛查卵巢癌风险人群，其敏感性达100%，特异性达95%，阳性预期值达94%，远优于CA125。Salekdeh等[26]研究了两个水稻品种（CT9993

和IR62266）干旱胁迫和复水10d后的叶片蛋白质组变化。在1000多个凝胶蛋白点上发现42个蛋白点的丰度在干旱胁迫下变化显著。复水后，所有蛋白点的丰度完全或非常接近处理前。在经质谱鉴定的16个与水分胁迫的相关蛋白中，4个是与干旱胁迫相关的蛋白及与之相对应的响应干旱的机制。本研究应用双向电泳技术对冬虫夏草发育过程中的三个阶段（菌虫复合体、子座、整体）的蛋白质组进行分析，筛选出稳定存在的蛋白质和具有显著差异的蛋白质，验证前期冬虫夏草指标性蛋白质并为后续研究奠定基础。1仪器与材料1.1仪器低温高速离心机：贝克曼X-22R型双向电泳系统：Bio-Rad公司凝胶扫描成像系统：

Bio-Rad公司电热恒温鼓风干燥箱：上海岛韩实业公司DHG-9035A型1.2药材人工冬虫夏草、小金蝠蛾幼虫样品于2017年采自四川省阿坝州小金县经成都中医药大学国锦琳教授鉴定为人工冬虫夏草、小金蝠蛾幼虫，留样标本存放于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。1.3试剂聚丙烯酰胺预混液、甘氨酸、BSA（纯度≥99%）、Tris碱、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、过硫酸铵、覆盖琼脂糖、QuickStart™Bradford1x

DyeReagent、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、IPG胶条(17cm，pH3-10)、Bio-Lyte

(pH3-10)、DTT、PrecisionPlusProtein™

预染标准品、矿物油均购自Bio-Rad公司；PMSF、AP、考马斯亮蓝R-250、低熔点琼脂糖、溴酚蓝、-巯基乙醇、Tween-80、购自鹏程生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、TCA、丙酮、甲醇、冰乙酸购自成都科龙化工试剂厂，均为分析纯；水为去离子水。1.4主要试剂配置PBS缓冲液(0.02mol/L,pH=7.2)：5.16gNa2HPO4，0.87gNaH2PO4，超纯水溶解定容至100mL。蛋白质提取液：PBS缓冲液(0.02mol/L,pH=7.2)，0.2%Tween80，0.2%β-巯基乙醇，1mMPMSF。10%TCA-丙酮：20gTCA，0.14gDTT，加丙酮溶解，定容至200mL，-20℃预冷。10%SDS：10gSDS，少量超纯水加热溶解，定容至100mL，混匀，室温保存。10%APS：0.1gAPS，用时加入1mL超纯水溶解，4℃保存。10×电泳缓冲液(10×=25mMTris,192mM

甘氨酸，0.1%SDS,pH8.3)：30gTris碱，144g甘氨酸，10gSDS，适量超纯水溶解，定容至1000mL，混匀后室温保存。胶条平衡缓冲液母液：72g尿素，4gSDS，适量超纯水溶解，加入50mL

Tris-HCl(1.5MpH8.8Tris-HCl)，20mL甘油，定容至100mL。分装，-20℃保存。水化上样缓冲液：4.2g尿素，1.52g硫脲，0.4gCHAPS，0.098gDTT，适量超纯水溶解，加入50L40%Bio-Lyte，10L溴酚蓝(1%)，超纯水定容至10mL。分装，-20℃保存。胶条平衡缓冲液I：0.2gDTT，10mL胶条平衡缓冲液母液，充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II：0.2g碘乙酰胺，10mL胶条平衡缓冲液母液，充分混匀，用时现配。2实验方法2.1冬虫夏草、菌丝体及虫体蛋白质的提取2.1.1蛋白质的提取取样品粉末约0.2g，加入0.02mol•L-1PBS

缓冲液(pH7.2)5mL(1%PMSF)，充分研磨至糊状，4℃浸提过夜。取出离心，4℃，13000rpm，30min，重复离心，收集上清液。2.1.2蛋白质的保存将2.1.1得到的上清液用Bradford[27]法测定其含量，用0.22微米的微孔滤膜膜除菌，无菌分装于0.5mLEP中，进行标记，置4oC保存备用。2.2蛋白质含量测定2.2.1标准曲线制备配制BSA标准溶液(1mg/mL)，按下表制作蛋白质定量标准曲线，用紫外分光光度计检测OD595并记录。表1.Bradford法蛋白质定量标准曲线的制备Table1.Preparationofastandardcurveforproteinquantification图4

Bradford法测定冬虫夏草蛋白含量标准曲线

Figure.4StandardcurveofOphiocordycepssinensisproteincontentdeterminedbyBradfordmethod2.2.2样品含量测定取2.1.1项下蛋白粗提液50uL，采用2.2.1项进行蛋白质含量测定。2.3蛋白质纯化（TCA-丙酮沉淀蛋白[28]）取2.1.1项下蛋白粗提取液，加入10倍体积TCA-丙酮(10%TCA,0.07%DTT)，漩涡混合后于-20℃静置1h，离心，10min，13000rpm，弃去上清液；加入-20℃预冷丙酮洗涤4次，室温自然干燥后水化用上样缓冲液溶解，低温震摇1h，离心取上清液，再次离心，取上清液保存备用。2.4双向电泳凝胶[28][29]采用2.3.1项蛋白质样品，上样量为600µg。第一向以不搭盐桥的方式进行水化，设置水化温度20℃，被动水化12~16h。第二向SDS参照郭尧君[30]方法，凝胶浓度12%T，电泳过程起始采用低电流10mA/gel，一小时后改变电流为30mA/gel，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。2.5染色电泳结束后采用考马斯亮蓝法（0.1%考马斯亮蓝R250，45%甲醇，10%冰乙酸）染色，过夜，脱色液（10%甲醇，10%冰乙酸）摇床脱色至背景脱色干净。2.6凝胶扫描及图像分析用ImagescanerII透射扫描仪对凝胶进行扫描，分辨率为150dpi，保存图像。使用PDQUESTTMBasic(Bio-Rad)和SPSS进行图像和数据的处理分析。3结果3.1蛋白质含量分析表2

不同来源冬虫夏草蛋白质含量(n=3)Table2ProteincontentofOphiocordycepssinensisfromdifferentsources(n=3)P＞0.053.2蛋白质斑点数量分析表3

不同来源冬虫夏草蛋白斑点数(n=3)Table3

proteinspotsofOphiocordycepssinensisfromdifferentsources(n=3)P＞0.053.3冬虫夏草及伪品差异斑点验证图5.前期课题组鉴定正伪品26个差异蛋白Figure5.Earlyidentificationof26authenticityproductsinthestudygroup图6.人工冬虫夏草验证得到20个差异蛋白Figure6.Verificationof20differentialproteinsbyartificialOphiocordycepssinensis图7.人工冬虫夏草子座验证得到14个差异蛋白Figure7.Verificationof14differentialproteinsbyartificialOphiocordycepssinensisstroma3.4差异蛋白分析3.4.1人工冬虫夏草、小金蝠蛾幼虫差异蛋白分析利用PDQUESTTMBasic软件对冬虫夏草图谱进行匹配分析后，建立人工冬虫夏草共有蛋白凝胶作为参照胶，以小金蝠蛾幼虫图谱为分析胶进行组间匹配，进行差异表达分析后得到感光度sensity=3.0的差异表达蛋白点。结果显示，在人工冬虫夏草与小金蝠蛾幼虫的对比分析中，人工冬虫夏草与小金蝠蛾幼虫存在共有蛋白斑点7个，如图10。图10.人工虫草与小金蝠蛾幼虫共有的蛋白Figure10.ProteinsSharedbytheartificialOphiocordycepssinensisandthelarvaofHepialusxiaojinensis3.4.2人工冬虫夏草子座、人工冬虫夏草菌虫复合体、人工冬虫夏草差异蛋白分析利用PDQUESTTMBasic软件对冬虫夏草图谱进行匹配分析后，建立人工冬虫夏草共有蛋白凝胶作为参照胶，以人工冬虫夏草菌虫复合体、人工冬虫夏草子座图谱为分析胶进行组间匹配，进行差异表达分析后得到感光度sensity=3.0的差异表达蛋白点。结果显示，在人工冬虫夏草与人工冬虫夏草子座、人工冬虫夏草菌虫复合体的对比分析中，三者存在共有蛋白斑点34个，如图11；在人工冬虫夏草子座-人工冬虫夏草菌虫复合体-人工冬虫夏草这一生长发育过程中，冬虫夏草整体仅与人工冬虫夏草菌虫复合体共有蛋白35个，仅与人工冬虫夏草子座共有的蛋白4个，如图12；成为人工冬虫夏草整体后，对比前两个阶段新产生蛋白14个，如图13；最终筛选出8个表达量大、稳定，斑点清晰的蛋白质点，其中新产生蛋白3个，稳定存在斑点5个进行后续研究，如图14。图11.人工冬虫夏草子座、人工冬虫夏草菌虫复合体、人工冬虫夏草共有的蛋白Figure11.ProteinsharedbytheartificialOphiocordycepssinensis,mycoticcomplexofOphiocordycepssinensisandthelarvaofHepialusxiaojinensis17图12.圆形表示人工冬虫夏草仅与菌虫复合体共有的蛋白，方形标记仅与子座共有的蛋白Figure12.CirclesindicatethatartificialOphiocordycepssinensisonlysharesproteinwiththeOphiocordycepssinensis,andsquaremarksonlyshareproteinswiththestroma.图13.仅在人工冬虫夏草中存在的蛋白Figure13.ProteinsfoundonlyinartificialOphiocordycepssinensis图14.筛选送检8个蛋白Figure14.Eightproteinsscreened4.小结4.12-DE图像分析本部分所用实验材料为冻干冬虫夏草，药材在干燥加工过程中部分蛋白质可能会出现降解、变性，与新鲜药材、幼嫩组织器官相比，蛋白质提取纯化工作难度较大。本部分试验在前期方法的基础上，获得了质量较高的2-DE图谱。2-DE

图谱分析结果显示冬虫夏草蛋白质较丰富，在分子量10kD-90kD的范围内普遍分布，多样性良好。人工冬虫夏草各部分蛋白质斑点分布模式相似，显示出蛋白质在生物体内表达的稳定性。同时图像对比分析发现，子座部分虽然与人工冬虫夏草整体及虫体2-DE图谱相似，具有相似的蛋白质成分表达，但蛋白质数量较少，提示在冬虫

夏草菌侵染小金蝠蛾幼虫的过程中，各种因素相互作用产生了大量新的蛋白质。4.2前期冬虫夏草与混伪品差异斑点验证前期课题组通过双向电泳技术(2-DE)得到冬虫夏草指标性蛋白质点26个，正品冬虫夏草来源于四川（康定雅加梗、马尔康县梭磨乡）、西藏那曲、青海西宁，混伪品为凉山虫草、古尼虫草、金针虫虫草、蛹虫草及其它伪制品[29]。本课题在课题组前期的基础上，对人工冬虫夏草、人工冬虫夏草菌虫复合体、人工冬虫夏草子座、小金蝠蛾幼虫进行2-DE分析，建立蛋白质双向电泳图谱，使用PDQUEST对其进行图像分析，验证得到人工冬虫夏草整体20个指标性蛋白质、人工冬虫夏草菌虫复合体18个指标性蛋白质、人工冬虫夏草子座14个指标性蛋白质、小金蝠蛾幼虫4个指标性蛋白质。5讨论5.1小金蝠蛾幼虫—人工冬虫夏草差异蛋白分析图谱显示，小金蝠蛾幼虫与人工冬虫夏草的蛋白组有明显差异，蛋白质分布和种类上全然不同，且小金蝠蛾幼虫的蛋白质含量也远高于人工冬虫夏草，两者之间的共有蛋白质极少，表明小金蝠蛾幼虫与冬虫夏草具有两套不同的蛋白组，小金蝠蛾幼虫被冬虫夏草菌侵染后蛋白质发生了巨大的变化。5.2人工冬虫夏草子座—人工冬虫夏草差异蛋白分析图像对比分析发现，人工冬虫夏草子座与全体蛋白质斑点分布模式相似，具有相似的蛋白成分表达，蛋白质含量相差无几，但蛋白质数量和种类上少于全体，部分蛋白质在冬虫夏草的生长中稳定表达。提示小金蝠蛾幼虫被冬虫夏草菌侵染后有新的蛋白质形成。5.3基于蛋白质组分析冬虫夏草的生长发育在冬虫夏草的形成过程中，蛋白质含量及种类最高的是小金蝠蛾幼虫，在小金蝠蛾幼虫被冬虫夏草菌侵染后蛋白质含量和种类均大幅度降低，表明这一阶段有大量的蛋白质产生。菌虫复合体与子座的蛋白质分布和表达相似，但子座的蛋白质含量和种类不及菌虫复合体，子座的蛋白质含量和种类也少于完整的冬虫夏草，表明冬虫夏草形成过程中的新蛋白在这一阶段产生。5.4差异性蛋白质筛选本部分研究通过2-DE分析技术，获得了人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、

子座及小金蝠蛾幼虫的蛋白质表达图谱。图谱分析发现人工冬虫夏草样品及小金蝠蛾幼虫的蛋白质组均显示出良好的多样性，蛋白质种类丰富，且菌虫复合体、子座与人工冬虫夏草整体蛋白质斑点分布模式相似，同时采用PDQUESTTMBasic软件对人工冬虫夏草各样品2-DE图谱进行匹配分析，筛选出冬虫夏草发育过程

的三个阶段稳定存在的蛋白斑点34个，成为冬虫夏草整体后，对比前两个阶段新产生蛋白斑点14个，并对其中8个表达量大、稳定，斑点清晰的蛋白质点进行

LC-MS/MS鉴定。第三章冬虫夏草发育阶段差异蛋白的鉴定与分析质谱(massspectrometry,MS)技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的特点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后修饰。质谱法分析蛋白质的原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。在生物化学、细胞生物学等领域应用广泛，大多与PAGE、2-DE等联用分析蛋白质。张金兰等[31]利用液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HRMS)，建立了用于复杂生物基质中来自多个活性成分的代谢物全貌分析的质谱树形相似过滤技术，并将其应用于淫羊藿代谢产物的分析，实现了来自5个淫羊藿黄酮苷的115个代谢物的同时结构确认。刘淑莹等[32]利用LC-MS指纹图谱技术，结合抗氧化活性评价及化学计量学方法，从近百种样本中筛选出五味子的优良品种。他们还利用乌头类生物碱的骨架结构特点，根据多级串联质谱特征碎片，建立了乌头类生物碱的HPLC/ESIMS/MSn

分析方法[33]，从乌头类植物中鉴定出上百种生物碱类成分，其中近半数为首次发现。肖红斌等[34]利用基于UPLC-QTOF-MS的血清代谢组学方法，研究了金贵肾气丸及六味地黄丸对肾虚模型动物的治疗效果，将差异及轮廓分析用于发现与肾虚模型相关的主要生物标记物，将PCA用于评价药物及其代谢物的影响。课题组前期利用质谱技术分析了8个经2-DE分离得到的冬虫夏草指标性蛋白质以及正伪品21个指标性蛋白质，本研究对3个冬虫夏草生长发育阶段新产生的差异性蛋白质，5个稳定存在的蛋白质进行质谱鉴定分析，搜索NCBI数据库，得到差异性蛋白质分子量、等电点、生物功能等信息，为研究冬虫夏草的生长发育提供依据。1仪器与材料1.1仪器IKA振荡器低温高速离心机：贝克曼X-22R型microTOF-QII：德国BrukerDaltonics布鲁克·道尔顿1.2样品前期双向电泳筛选出的8个蛋白质斑点。1.3试剂DTT、IAM购自Promega公司，NH4HCO3购自成都科龙化工试剂厂，均为分析纯。乙腈购自美国赛默飞世尔（中国）公司、色谱纯。水为超纯水，美国Millpore公司。1.4主要试剂配置脱色液：1.25mL100mmol/LNH4HCO3，2.5mL100%乙腈，1.25mL超纯水，混匀，备用。还原剂：2mL100mmol/LNH4HCO3，10mMDTT，混匀，备用。烷基化试剂：1mL100mmol/LNH4HCO3，40.69mgIAA，3mL超纯水，混匀，备用。2方法[35-53]2.1蛋白胶内酶解2.1.1胶內蛋白斑点回收用直径20mm枪头将SDS

凝胶中目标蛋白质点条带切胶回收，置于1.5mL灭菌EP

管中，编号；将胶用超纯水润洗3次，每次振荡1min，放置15min，以除去胶中的SDS等杂质，弃液体。即得蛋白质谱样品。2.1.2胶内蛋白质谱前处理脱色加入1mL脱色剂，清洗10min，脱色至胶块完全透明；将胶块取出，用乙腈脱水直达胶块变为白色，真空抽干乙腈；加入还原剂使胶粒完全吸收，56℃恒温水浴1h后，冷却至室温。烷基化取出样品，弃去多余液体，迅速加入55mM烷基化试剂(IAM)，室温避光孵育45min。弃去多余液体，加入50%乙腈，静置20min后弃去液体，加入25mMNH4HCO3，振荡，静置吸胀10min，弃液体，重复上述操作。脱水消化用50%乙腈将胶清洗2次，用50%乙腈脱水后再用100%乙腈脱水，每次5min，脱水至胶块变为白色，真空抽干乙腈；将1ug•uL-1用25mMNH4HCO3稀释15倍后，加入胶块中，37℃水浴消化过夜。萃取在样品加入0.1%的FA终止消化。12000r•min-1

超声5min，吸取上清液至新的EP管中，余下胶块加入萃取液，37℃恒温放置30min，超声，合并上清液。将样品溶液冷冻干燥处理，为待测样品。2.2质谱分析取10uL样品上清液进行质谱仪分析。用Mascot

软件进行数据库检索肽段信息，得质谱结果。3结果质谱图及其匹配的氨基酸序列如下。将获得的8种蛋白质N-端序列与NCBI蛋白质数据库中进行比对。4小结4.1差异蛋白数据库分析质谱图及其匹配的氨基酸序列如下。将获得8种蛋白质N-端序列与NCBI蛋白质数据库中进行比对。8种蛋白均来自于全库。表4.8个差异蛋白质按等电点范围分类Table4.8differentialproteinsclassifiedbyisoelectricpointrange表5.8个差异蛋白按分子量范围分类Table5.8DifferentialProteinsbyMolecularWeightRange表6.8个差异蛋白数据库检索结果Table6.8resultsofdifferentialproteindatabaseretrieval图15-图22.

斑点1-8得分最高的肽段质谱图

Figure15-22.Peptidespectrawiththehighestscoreforspot1-84.2差异蛋白的生物功能分析4.2.1生物功能概述斑点1为肌动蛋白(actin)，是一类高度保守的蛋白质，存在于所有真核细胞中,

参与细胞分裂、运动、迁移、形态的维持、生长等多种重要生理活动。细胞中肌动蛋白常与其结合蛋白(actinbindingprotein,ABP)结合，以单体（globularactinmonomer，G-肌动蛋白）、寡聚体及聚合体（filamentactin,，F-肌动蛋白）形式存在，执行不同的生理功能，聚合和非聚合形式的肌动蛋白在细胞中处于一种动态平衡[54]。斑点2为甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶(Mannitol-1-phosphate5-dehydrogenase)，其参与甘露醇代谢过程。甘露醇具有利尿、脱水、镇咳、祛痰、平喘、提高血浆渗透压、清除人体内强毒性的羟自由基等作用，并且对多种疾病有一定的疗效。这与虫草补肺益肾、止咳化痰、强身健体的功效相一致[55]，并且虫草类的保健品一般以甘露醇的含量作为其中的质控指标[56]。斑点3为含β-内酰胺酶结构域蛋白(beta-lactamasedomain-containingprotein)。根据NCBI生物咨询学，含β-内酰胺酶结构的蛋白质是一种冬虫夏草特有的蛋

白[57]。斑点4为转醛缩酶(Transaldolase)，其对于戊糖磷酸途径(pentosephosphate

pathway,PPP)中代谢物的平衡非常重要。戊糖磷酸途径(pentosephosphatepathway,PPP)是植物体中糖代谢的重要途径，其主要生理功能是产生供还原性生物合成需要的NADPH以及可供核酸代谢的磷酸戊糖，一些中间产物则可参与氨基酸合成和脂肪酸合成等。已有研究表明,戊糖磷酸途径与植物的生长发育和各种环境胁迫等密切相关[58]。斑点5属于甘油醛/磷酸甘油脱氢酶家族(Glyceraldehyde/Erythrosephosphatedehydrogenasefamily)，其对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAD+)（磷酸化）活性有重要的影响。甘油醛-3-磷酸脱氢酶是叶绿体卡尔文环中的一种重要的调节酶，它是卡尔文环中唯一利用由光系统I产生的还原能力(NADPH)催化光合作用的最初产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)还原成3-磷酸甘油醛[59]。斑点6与斑点8均被鉴定为假设蛋白(hypotheticalprotein)。斑点7为GTP结合核蛋白(GTP-bindingnuclearprotein)，GTP结合蛋白广泛存在于原核和真核生物中，参与细胞内一系列的信息传递过程，如：跨膜信使物质的信号传递，光信号的传递，蛋自质的生物合成，细胞骨架组织的形成等等，其共同特点是结合并利用GTP[60]。4.2.2GO注释分析通过GO注释比较发现，冬虫夏草全体阶段新产生的斑点1.5.6共同参与了

细胞(cell)、细胞区域(cellpart)、细胞组分(cellularcomponent)、细胞内(intracellular)、细胞内部分(intracellularpart)过程。此外，斑点1参与大量核苷酸结合和酶活性过程，如核苷酸结合(ribonucleotidebinding)、焦磷酸酶活性(pyrophosphataseactivity)、嘌呤核苷酸结合(purineribonucleotidebinding)、嘌呤核苷酸结合(purine

nucleotide

binding)

、核苷三磷酸酶活性

(nucleoside-triphosphataseactivity)、在含磷酸酐中作用于酸酐的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides,inphosphorus-containinganhydrides)、作用于糖基键的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonglycosylbonds)、水解酶活性(hydrolaseactivity)、碳水化合物衍生结合(carbohydratederivativebinding)、ATP结合(ATPbinding)、腺嘌呤核苷酸结合(adenylribonucleotidebinding)、腺苷酸核苷酸结合(adenylnucleotidebinding)过程等；斑点5参与了大量代谢过程和化

合物结合过程，如小分子代谢过程(smallmoleculemetabolicprocess)、单生物体代谢过程(single-organismmetabolicprocess)、小分子结合(smallmoleculebinding)、有机环状化合物结合(organiccycliccompoundbinding)、核苷结合(nucleoside

binding)、核苷磷酸结合(nucleosidephosphatebinding)、杂环化合物结合(heterocycliccompoundbinding)等；斑点6参与了大量代谢过程和细胞生长过程，如单生物体代谢过程(single-organismmetabolicprocess)、初级代谢过程(primary

metabolicprocess)、代谢过程(metabolicprocess)细胞器(organelle)、线粒体(mitochondrion)、膜部分(membrancepart)、膜(membrance)、膜的固有组成部分(intrinsiccomponentofmembrance)、细胞内细胞器(intracellularorganelle)、细胞内有膜的细胞器(intracellular

membrance-bounded

organelle)

、细胞骨架(cytoskeleton)、细胞骨架部分(cytoskeletonpart)等。冬虫夏草生长过程稳定存在的斑点2.3共同参与了刺激过程(responsetostimulus)、核苷三磷酸酶结合(nucleoside-triphosphatasebinding)。此外，斑点2参与了大量的细胞器过程和结合过程，如：细胞器部分(organellepart)、核部分(nuclearpart)、细胞内的细胞器部分(intracellularorganellepart)、细胞骨架部分(cytoskeletonpart)、碳水化合物衍生结合(carbohydratederivativebinding)、ATP结合(ATPbinding)、阴离子结合(anionbinding)、腺嘌呤核苷酸结合(adenylribonucleotidebinding)、腺苷酸核苷酸结合(adenylnucleotidebinding)；斑点3参与了大量的细胞骨架过程和嘌呤核苷酸结合过程，如：细胞骨架(cytoskeleton)、细胞骨架部分(cytoskeletonpart)、胞质部分(cytoplasmicpart)、嘌呤核苷酸结合(purineribonucleotidebinding)、三磷酸嘌呤核苷酸结合(purineribonucleotidetriphosphatasebinding)、嘌呤核苷酸结合(purinenucleotidebinding)、核苷酸结合(nucleotidebinding)等。斑点4

大量参与了有机氮化合物代谢过程(organonitrogencompoundmetabolicprocess)、细胞组分(cellularcomponent)、金属离子结合(metalionbonding)、阳离子结合(cationbonding)等。斑点7除参与细胞过程外还大量参与生物调节过程和水解酶活性过程，如：细胞过程的调节(regulationofcellularprocess)、生物过程的调节(regulationofbiologicalprocess)、生物调节(biologicalregulation)、焦磷酸酶活性(pyrophosphataseactivity)、在含磷酸酐中作用于酸酐的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides,inphosphorus-containinganhydrides)、作用于酸酐的水解酶活性(hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides)等。斑点8除参与细胞过程和膜过程外，大量参与了各种运输过程和转录合成过

程，如：单价无机阳离子运输(monovalentinorganiccationtransport)、离子运输(ion

transport)、离子跨膜运输(ion

transmembrane

transport)、氢运输(hydrogen

transport)、氢离子跨膜运输(hydrogeniontransmembranetransport)、阳离子跨膜运输(cationtransmembranetransport)、质子传输双段ATPase复合物，催化域(proton-transportingtwo-sectorATPasecomplex,catalyticdomain)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录(transcriptionfromRNApoiymerase

Ⅱpromoter)、核糖体生物合成(ribosomebiogenesis)、核糖核蛋白复合物的生物发生(ribonucleoproteincomplex

biogenesis)、质子传输双段ATP酶复合物(proton-transportingtwo-sectorATPase

complex)、质子转运ATP合成酶复合物(proton-transportingATPsynthasecomplex)、蛋白复合物(proteincomplex)、核(nucleus)、膜蛋白复合物(membraneproteincomplex)等。4.2.3KEGG通路富集分析最后对8个蛋白质进行了KEGG功能注释的比较分析，进一步了解其在各个代谢通路活跃程度的差异。斑点1活跃的代谢途径集中在磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositolsignalingsystem)、吞噬小体(phagosome)；斑点2活跃的代谢途径集中在金字塔代谢(pyramidmetabolism)；斑点3活跃的代谢途径集中在内吞作用(endocytosis)、紧密连接(tightjunction)：斑点4活跃的代谢途径集中在氮代谢(nitrogenmetabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesisofaminoacid)；斑点5活跃的代谢途径集中在单环内酰胺生物合成(monobactambiosynthesis)、维生素B6代谢(vitaminB6metabolism)、硫代谢(sulfurmetabolism)；斑点6活跃的代谢途径集中在维生素B6代谢(vitaminB6metabolism)；斑点7活跃的代谢途径集中在叶酸生物合成(folatebiosynthesis)、药物代谢—细胞色素P450(drugmetabolismcytochromeP450)、非核糖体肽结构(nonribosomalpeptidestructures)、HTLV-I感染(HTLV-Iinfection)、爱泼斯坦-

巴尔病毒感染(Epstein-Barrvirusinfection)；斑8活跃的代谢途径集中在谷胱甘肽代谢(Glutathionemetabolism)、真核生物核糖体合成(Ribosomebiogenesisineukaryotes)。5讨论对冬虫夏草蛋白组的分析是试图从蛋白质层面上研究冬虫夏草的生长发育，另一方面也有利于从中找寻有价值的蛋白信息。我们通过SDS分离蛋白，然后切胶后进行LC-MS/MS质谱鉴定，利用Mascot软件搜索冬虫夏草已经公布的蛋白质数据库，得到需要的蛋白质数据。经对比分析共鉴定3个冬虫夏草发育阶段新产生的差异性蛋白质，5个稳定存在的蛋白质。越来越多的蛋白质组研究开始用2-DE，使复杂蛋白质能够分离的更开，本研究使用2-DE研究冬虫夏草的蛋白质组，能比较直观的看到数个比较样本的蛋白数量、分布的变化。我们对鉴定出的8个蛋白质进行了GO、KEGG两种功能注释，并进行了较为系统的比较。5个稳定存在的蛋白质在核苷酸结合及代谢，转录调节，细胞内活动比较活跃；3个发育阶段新产生的蛋白质在碳水化合物代谢，化合物结合、细胞骨架的生物合成等会相对活跃。这些结果与转录组得到的结论相符，也与真菌发育所需相一致，在子实体形成阶段，细胞骨架的合成会相对活跃。斑点1鉴定为肌动蛋白，GO注释发现该蛋白大量参与了细胞、细胞区域、细胞组分、细胞内、细胞内部分等过程，KEGG注释发现其活跃的代谢途径为磷脂酰肌醇信号系统、吞噬小体，提示肌动蛋白可能在冬虫夏草的生长发育中其重要作用。这些结论与转录组得到的结论相符。本研究对冬虫夏草生长阶段蛋白组的分析仅处于比较初步的阶段，要更深入分析，可以进行冬虫夏草的全蛋白质组分析研究，更系统的了解冬虫夏草各个生长阶段蛋白质的表达情况。第四章野生冬虫夏草、人工冬虫夏草蛋白质组分析1975年，意大利生化学家O'Farell建立了经典的2-DE技术，并首次成功用于分离约1000个大肠杆菌、老鼠及几尼猪的蛋白质斑点，但蛋白质谱不稳定，易随环境而变化[61]。经过近40年的发展，伴随着如固相pH

梯度凝胶电泳,

差异凝胶电泳,

质谱技术等的建立与完善，2-DE技术已日趋成熟，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。2007年，Wang

等[62]采用蛋白质组学技术从分子水平考察复方双丹（丹参和丹皮）煎剂抗大鼠急性心肌梗死的作用机制，运用2-DE和MALDI-TOFMS结合技术分离和鉴定了23个差异蛋白，这些蛋白分别与能量代谢、氧化应激和细胞骨架有关，从而整体阐述了双丹煎剂通过调节心肌能量代谢、抗氧化应激损伤等多途径发挥抗心肌梗死的作用。Qi[63]等运用蛋白质组学研究桃红四物汤对氧糖剥夺脑缺血再灌注损伤PC12细胞凋亡的保护机制，采用2-DE结合MALDI-TOFMS

分析了26个与桃红四物汤调控作用相关的蛋白质，并鉴定这些蛋白参与多种重要的生化过程，具有不同的生理功能。本研究应用双向电泳技术对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座的蛋白质组进行分析，筛选出野生冬虫夏草及人工冬虫夏草差异性蛋白质，验证前期冬虫夏草指标性蛋白质并在蛋白质层面揭示了野生冬虫夏草与人工培育冬虫夏草的差异，为鉴别野生、人工冬虫夏草提供资料。1仪器与材料1.1仪器低温高速离心机：贝克曼X-22R型双向电泳系统：Bio-Rad公司凝胶扫描成像系统：

Bio-Rad公司电热恒温鼓风干燥箱：上海岛韩实业公司DHG-9035A型1.2试剂聚丙烯酰胺预混液、甘氨酸、BSA（纯度≥99%）、Tris碱、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、过硫酸铵、覆盖琼脂糖、QuickStart™Bradford1x

DyeReagent、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、IPG胶条(17cm,pH3-10)、Bio-Lyte

(pH3-10)、DTT、PrecisionPlusProtein™

预染标准品、矿物油均购自Bio-Rad公司；PMS、APS、考马斯亮蓝R-250、低熔点琼脂糖、溴酚蓝、-巯基乙醇、Tween-80、购自鹏程生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、TCA、丙酮、甲醇、冰乙酸购自成都科龙化工试剂厂，均为分析纯；水为去离子水。1.3主要试剂配置PBS缓冲液(0.02mol/L，pH=7.2)：5.16gNa2HPO4，0.87gNaH2PO4，超纯水溶解定容至100mL。蛋白质提取液：PBS缓冲液(0.02mol/L，pH=7.2)，0.2%Tween80，0.2%β-巯基乙醇，1mMPMSF。10%TCA-丙酮：20gTCA，0.14gDTT，加丙酮溶解，定容至200mL，-20℃预冷。10%SDS：10gSDS，少量超纯水加热溶解，定容至100mL，混匀，室温保存。10%APS：0.1gAPS，用时加入1mL超纯水溶解，4℃保存。10×电泳缓冲液(10×=25mMTris,192mM

甘氨酸，0.1%SDS,pH8.3)：30gTris碱，144g甘氨酸，10gSDS，适量超纯水溶解，定容至1000mL，混匀后室温保存。胶条平衡缓冲液母液：72g尿素，4gSDS，适量超纯水溶解，加入50mL

Tris-HCl(1.5MpH8.8Tris-HCl)，20mL甘油，定容至100mL。分装，-20℃保存。水化上样缓冲液：4.2g尿素，1.52g硫脲，0.4gCHAPS，0.098gDTT，适量超纯水溶解，加入50L40%Bio-Lyte，10L溴酚蓝(1%)，超纯水定容至10mL。分装，-20℃保存。