蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定一、 实验目的学习考马斯亮蓝测定蛋白的原理了解分光光度计的使用注意小组的分工合作二、 原理考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，后者最大光吸收在595nm。蛋白浓度在0-100pg/ml范围以内，蛋白质-色素结合物在595nm下吸光度与蛋白质含量呈正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。三、 仪器、器皿及试剂天平、试管、吸管、研钵、50ml容量瓶、离心管标准牛血清蛋白液（100曜/ml）、G-250溶液。四、实验步骤1.标准曲线绘制取6支试管编号，按下表数据配制项目123456标准Pr（ml）0.00.20.40.60.81.0蒸馅水（ml）1.00.80.60.40.20.0G-250（ml）5.05.05.05.05.05.0Pr含量（两020406080100配制完毕，摇匀后，放置2min，在595nm下测定吸光值。2.样品蛋白质含量测定准确称量1g菠菜和青菜，加入5ml蒸馏水研磨，研磨成匀浆，离心（4000r/min，10mins）后，上清液转入50ml容量瓶，并用蒸馏水定容。取0.1ml样品提取液，按下表配制项目菠菜青菜123456样品（ml）0.10.10.10.10.10.1H2O（ml）0.90.90.90.90.90.9G-250（ml）5.05.05.05.05.05.0配制完毕，摇匀后，放置2min，在595nm下测定吸光值。五、作业1.标准曲线的绘制1 2345 6OD595 0.000 0.7871.2021.3941.465 1.490因为曲线的刖部分是呈线性的，后面逐渐与x轴平行，再加上所测数据主要集中在吸光值0.050-0.150之间，在图像的前段，所以经过讨论后，我组将第5、6个数据去除，而保留了第1、2、3、4个数据，最后得出了如下图的标准曲线。2.计算样品中蛋白质含量根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。项目菠菜青菜123456°D5950.1050.0910.0810.1380.1140.147Pr含量（ug）3.9923.4603.0805.2474.3355.589平均（理）3.5115.507据上述操作所知，所测样品的稀释倍数为500倍，即可知：菠菜的蛋白质含量=3.511ugx500=1755.5ug=1.756mg青菜的蛋白质含量=5.507ugx500=2753.5ug=2.754mg即是说，1g菠菜中含有1.756mg的蛋白质，即菠菜的蛋白质含量为1.756%。；1g青菜中含有2.754mg的蛋白质，即青菜的蛋白质含量为2.754%。。3.实验结果分析及讨论青菜的蛋白质含量比菠菜的蛋白质含量高1%。左右。误差分析：标准曲线制作过程中，所测量的溶液用的是1ml的体系，这样溶液加多加少本身会有一定的区别。所以配置标准液时，最好是由一个人操作，或至少由一个人将一种溶液加完；还有就是测量的溶液体系最好可以在大一点，这样由操作引起的误差可以降低一些。在测定吸光值时，需先将分光光度计打开预热，目的是稳定它的波长；因为测量数据是分两步进行的，所以最好用同一台仪器测定。吸光值测定时，最好是使用的同一个空白，因此在测完标准曲线的吸光值后，要将空白留下来，后面测样品的吸光值时使用；也可以同时配置两个空白，分两次使用。样品研磨时，一定要研磨充分，才能使蛋白质提取充分，若两种样品研磨的程度不同，那么提取蛋白质的程度也不相同，最后的结果也不具有可比性。结果中所测吸光值都偏小，一般最好是落在曲线的中间部位，否则就会影响测量的准确度，因此样品的稀释倍数最好可以适当减小，样品的测量体系也可以适当增大。建议：A.最好适当增大溶液测量的体系，如增加到5ml或10ml，一方面可以降低人为操作引起误差的影响，另一方面测量时润洗和测量都有足够的材料，若是对测量的结果不肯定，还可以用剩余的样品液再测一次。B.标准曲线的绘制和样品的测量最好可以同时进行。静置的时间不同，显色反应的程度也就不同了，若用同一个空白，在测量完标准液后，过一段时间再测样品液，本身就存在有误差。所以，最好是先制备样品液的母液，然后标准液和样品液的测量体系可以一同配置，最后一起测量，也有助于减少误差。。.为了使蛋白质提取充分，可以适当增加离心的次数。其他：为了安全使用离心机，有时可以不必太严格的遵照实验操作的要求，比如此次试验，要求离心4000r/min10min，但所用的离心机最高转速在4000r，在使用时，可以稍微降低转速（如到3990r），稍微延长离心时间（如到11-12mi