耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌的分离鉴定

耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌的分离鉴定

肺炎克雷博菌是医院和社区感染的重要肠球菌。1998年至2004年，全球sentry监测项目上很少见光滑酪氨酸酶菌和红霉素类抗生素。表明碳青霉烯类抗生素是临床治疗多重耐药肠杆菌科细菌感染的最有效药物之一;但随着此类抗生素的大量使用,在世界各地陆续发现了碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌。本研究对我院从2006年1月至2011年2月的肺炎克雷伯菌临床分离株进行菌种鉴定和药敏试验,筛选出对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌,并研究其耐药机制和同源性。材料和方法一、临床菌株的筛选(一)菌株来源2006年1月至2011年2月临床标本中分离的非重复肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。产IMP-1临床菌株由浙江大学医学院附属第一医院俞云松教授惠赠;产VIM-1临床菌株由北京大学第一医院检验科孙丽颖老师惠赠,其他菌株为本实验室保存菌株。(二)培养基与抗菌药物纸片MH和LB培养基、10μg美罗培南、10μg亚胺培南纸片均为英国OXOID公司产品。二、碳青霉烯酶基因型检测(一)抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)测定用VITEK-Ⅱ全自动微生物分析仪和常规方法,进行菌种鉴定和药敏试验,筛选对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌;具体操作及折点判定参照(二)碳青霉烯酶测定1.改良Hodge试验:将0.5麦氏单位的大肠埃希菌(ATCC25922)1:10稀释后,均匀涂布在MH平皿上,中间贴10μg/片的美罗培南纸片,将实验菌株从纸片边缘向外划直线,35℃培养过夜,抑菌圈内出现凹进现象者为产碳青霉烯酶阳性,以肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705为阳性对照,ATCCBAA-1706为阴性对照。2.三维试验:按文献[2]用冻融法提取β内酰胺酶;取0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922菌液,接种MH琼脂平皿,平皿中心贴一10μg亚胺培南纸片,在距亚胺培南纸片5mm处划长约15mm的狭缝。取40μL的酶提取液加到狭缝中,35℃过夜,若抑菌圈内出现凹进现象者为产碳青霉烯酶阳性,以IMP-1为阳性对照,大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照。3.PCR扩增KPC酶和金属酶基因:用煮沸法提取细菌DNA,根据文献[3-6]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成KPC、IMP、VIM、SPM、GIM、NDM-1引物如表1。反应体系为25μL,反应过程各项参数为:94℃预变性5min,94.5℃30s,55℃30s(退火温度各个反应略有不同),72℃30s,30个循环;最后72℃延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像系统观察结果并照相。4.测序及DNA序列分析:基因阳性菌株,PCR产物提纯后由上海生工生物工程技术服务有限公司用ABIPRISM3700测序仪进行双向测序,测序结果在GenBank用BLAST与已知序列比较以确定其基因型。(三)质粒接合试验受体菌为NK5449(Nalr,Rifr),供体菌为临床株。从平皿上挑选单菌落接种在10mL左右液体MH培养基中36℃,200r/min培养过夜,用无菌生理盐水调节浊度至0.5个McFarland单位。取供体菌液100μL,受体菌液200μL,入10mL液体MH培养基,混合后静置于36C3h。制备LB培养基加入抗菌药物,分别为利福平300μg/mL+萘啶酸150μg/mL+头孢噻肟10μg/mL。同时设平行对照:对照I:利福平300μg/ml+萘啶酸150μg/mL;对照Ⅱ:头孢噻肟10μg/mL。将混合培养物接种于筛选平皿上,36C培养18～24h。供体菌在对照I上有生长的认为不适宜进行接合试验,NK5449如果在对照Ⅱ上有生长,认为质控不合格。用VITEK-Ⅱ进行接合子鉴定和药敏试验。(四)同源性分析用基因外重复回文(REP)-PCR对筛选出的4株碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌进行同源性分析,参考文献[7]设计引物,反应条件为94℃预变性10min,94℃变性1min,45℃退火1min,72℃延伸2min,共30个循环,最后72℃延伸10min。取REP-PCR产物5μL,设定电压100V,用1.2%琼脂糖凝胶电泳30min,溴化乙锭染色,紫外灯下观察结果。电泳图谱条带完全相同判定为同一克隆株。结果一、碳青霉属抗生素植物的筛选和药物过敏试验2006年1月至2011年2月临床标本中共分离826株非重复肺炎克雷伯菌,参照二、维试验检测用改良Hodge试验检测4株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶,未发现阳性菌株;用冻融法提取β内酰胺酶进行三维试验检测,发现1株阳性,另外3株阴性。出现不一致的结果并不奇怪,可能是这2种检测碳青霉烯酶方法的灵敏度和特异度不同所致。三、imp-4基因序列及测序结果经PCR扩增KPC、IMP、VIM、SPM、GIM、NDM-1基因,发现1株菌IMP基因扩增阳性(图1),测序结果在GenBank用BLAST与已知序列比较确定其基因型为IMP-4,与已在GenBank登录的IMP-4(登录号:FJ384365.1)有99%的同源性,我们把IMP-4基因序列提交到GenBank,申请的序列号为JN100667。4株细菌中均未检出KPC、VIM、GIM、SPM、NDM-1碳青霉烯酶基因。四、同粒试验将IMP-4阳性菌株进行质粒接合转移试验,结果为阴性,显示此株含IMP-4金属酶基因不能通过质粒接合转移到受体菌。五、rep-pcr分析图2显示,本院分离的4株碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌分为3型,其中A型2株,B型、C型各1株。菌株鉴定及耐药后确定亚胺培南或美罗培南是治疗革兰阴性杆菌感染的主要碳青霉烯类抗生素,临床分离的对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌不多见。从本监测结果看,我院2010年9月以前,未发现对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌,4株耐药菌集中在2010年9月、10月,和2011年2月,其中2株菌对所测试的所有抗菌药物均耐药,另2株菌也表现为多重耐药。对这4株菌的同源性,是否来源于同一克隆,我们用REP-PCR扩增、电泳,发现2株菌电泳图谱条带完全相同,判定为同一克隆株,这2株菌来源于ICU同一患者不同的标本:腹腔引流物和血液,提示此患者感染的是同一克隆株。另外2株细菌属于不同克隆株,因此本院分离出的4株对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌属于不同克隆型。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制,主要包括KPC酶和金属酶。KPC酶属于A类Bush2f组的可水解碳青霉烯的β内酰胺酶。文献报告KPC-2型肺炎克雷伯菌在我国广泛存在,但产金属酶的报道不多目前金属酶的筛选主要用EDTA协同试验,原理是EDTA可螯合Zn2+导致金属酶