抗生素的发酵生产-四环素的发酵生产

单元三抗生素类药物的发酵生产项目三四环素的发酵生产

任务二四环素的发酵生产（一）发酵生产流程（二）种子制备1.孢子制备麸皮斜面砂土管→母斜面→子斜面→种子罐→发酵罐控制要点（1）进行简单的自然分离，（2）节约砂土管的用量。影响因子：水、麸皮目前生产中为了保证水质稳定，一般是在蒸馏水中添加0.005%MgSO4，0.01%KH2PO4，0.015%(NH4)2HPO4等无机盐，溶解形成的水再用于配制培养基，所培养的菌落丰满，孢子层厚，孢子质量稳定，还能缩短孢子的成熟期。麸皮的质量要求为含糖6.5%，含氮2%，含磷0.6%左右，水分小于12%。加工麸皮用的小麦品种、产地与加工方法要稳定。另外温度和培养环境也应严格控制。2.种子制备培养基：蛋白胨、花生饼粉、淀粉培养条件：30～32℃，24～27h标志：菌丝形态处于第二期末或第三期初；菌体处于代谢旺盛阶段，C、N源明显被利用；pH值下降后又上升，达到pH＝6.0左右；培养液因菌丝增加而粘稠，色泽逐渐带黄色，有少量四环素出现影响因子：通气、搅拌（二）发酵工艺控制四环素生产一般采用二级或三级发酵方式1.培养基

N源：花生饼粉，黄豆饼粉，棉籽饼粉，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，尿素等

C源：淀粉，可溶性淀粉，葡萄糖，糖蜜，油脂等

无机盐影响磷酸盐对菌体生长和抗生素的合成有很大影响；镁盐、钙盐促进四环素生物合成；铁离子及其他无机离子（如硼、钴、锂、锌、钼、钨、铝等），抑制四环素的生物合成;培养基中的CaCO3能与菌体合成的四环素结合成四环素钙盐（水中溶解度很低），从而降低了水中可溶性四环素的浓度，促进菌丝体进一步分泌四环素。消沫剂:植物油、动物油抑氯剂抑氯剂的作用是抑制氯原子进入四环素分子结构，抑制金霉素的合成，增加四环素的产量。生产中加入的溴化钠主要是让溴和氯竞争，来抑制氯的活性。但抑氯效果不高，通常还要加入促进剂M（2-巯基苯并噻唑），溴化钠一起作用，抑制氯进入四环素分子，使金霉素的产量低于5%。此外，还有2，5-巯基-1，3，4-噻二唑等有效抑氯剂。各种抑氯剂的用量约为0.0001%～0.05%2.培养温度培养温度不仅影响四环素的产量，而且会改变金色链霉菌生物合成的方向。35℃以上时，只合成四环素。降低温度，则金霉素的合成加强。一般四环素发酵温度采用28～32℃。3.pH值的影响金色链霉菌生长的最适pH值为6.0～6.8，而生物合成四环素的最适pH值为5.8～6.0，在发酵不同阶段可用加入葡萄糖或淀粉和氨水等来控制所需的pH值。4.溶氧的影响

培养12～60h的阶段中菌丝量显著增加，菌丝的摄氧率达到高峰，溶解氧水平为发酵全程中的最低值。此阶段一旦出现任何导致溶解氧降低的因素，能明显改变菌体的正常代谢，影响四环素的生物合成。因此在整个发酵期间要不断通入无菌空气，并加以搅拌，满足菌体对溶解氧的要求。5.补料四环素发酵过程中需不断补充碳源，以供给金色链霉菌生长和合成四环素的需求。用加氨水的方法来调节发酵液的pH值，又增加了发酵液中的氮源。为了消除泡沫，补料中应加入消沫剂。同时还要加抑氯剂，以降低金霉素的合成，提高四环素的产量。单元三抗生素类药物的发酵生产项目三四环素的发酵生产

任务三四环素的提取和精制

根据四环类抗生素的理化性质，可以采用沉淀法、溶剂萃取法或离子交换法，从发酵液中提取四环素。生产上较多用沉淀法。在提炼过程中应特别注意防止四环素的破坏，防止其降解产物（差向、脱水衍生物和氧化产物等）污染成品。四环素的提取和精制发酵液滤液加草酸及黄血酸盐、硼砂等，调节pH到1.6~1.9；过滤酸化沉淀加氨水和氯化钙，调节pH到9，沉淀；过滤清液加草酸，复合物解离，四环素溶解，草酸钙沉淀；过滤沉淀溶解四环素粗品加酸，调节pH到4.6~4.8，沉淀；过滤沉淀四环素成品纯化调节pH到1.6~1.9，尿素复合物沉淀；过滤，丁醇萃取，结晶（一）发酵液的预处理1、原理在pH=4.5～7.2，四环类抗生素难溶于水，小于4大于8易溶于水。黄血盐、硫酸锌，能除去发酵液中的铁离子、蛋白质和其它多种离子色素。2、方法（1）酸化加草酸使发酵液酸化到pH=1.6～1.9，四环素转入液体中。在低温、短时进行。（能去除钙离子，析出的草酸钙能促使蛋白质凝固，提高过滤速度。草酸价格较贵和加速四环素的差向化。）（2）加纯化剂（黄血盐、硫酸锌）知识链接—四环素的异构化反应四环素在弱酸性（pH2～6）的溶液中，C-4二甲胺基会发生可逆的异构化，生成差向四环素。一般情况下，pH﹤2或pH﹥9，温度较低时，差向化速度很小。四环素类抗生素差向异构化后，抗菌活性大大减弱，对细胞的毒性却大大增强。如四环素，差向异构化后，抗菌活性降低为1/6，毒性增大70倍。（二）四环素的提取1、沉淀提取法原理：

四环素+氯化钙→四环素钙盐↓在pH=4.5～7.2，四环类抗生素难溶于水。方法一：滤液→pH=9.0→四环素钙盐↓→用草酸溶解，过滤，得滤液（四环素）→pH4.6～4.8→四环素粗碱↓→溶于草酸→活性炭脱色→pH=4.0，四环素碱成品方法二：直接将滤液调pH值至四环素等电点析出游离碱。发酵液先用酸酸化，然后加黄血盐、硫酸锌，过滤得滤液。滤渣以草酸溶液洗涤，滤液和洗涤液合并，控制滤液单位在7000U/ml左右，送去结晶。从四环素精碱制造盐酸盐，系利用其盐酸盐在有机溶剂中、在不同温度下有不同的结晶速度的性质。将四环素精碱悬浮在丁醇中，加入化学纯浓盐酸，温度不超过18℃，迅速过滤掉不溶解杂质，然后加热，即有盐酸盐析出。析出的盐酸盐用无水丙酮洗涤，干燥，得四环素盐酸盐成品。（二）四环素的提取2、溶剂萃取法原理：

四环素+季铵碱→复合物沉淀↓不溶于水；溶于有机溶剂在pH=4.5～7.2，四环类抗生素难溶于水。方法：滤液→pH=9.0→复合物沉淀↓→有机溶剂→水溶液→pH4.8→四环素粗碱↓（三）四环素纯化1.原理：四环素+尿素→pH=3.5～3.8，四环素-尿素↓

复合物不溶于水；溶于有机溶剂，分离成四环素和尿素。其盐酸盐在有机溶剂中，随温度升高，结晶速度增大。2.四环素纯化方法四环素粗碱四环素溶液四环素－尿素四环素碱四环素盐酸盐酸化，pH1.5尿素，pH3.5丁酯萃取盐酸盐结晶单元三抗生素类药物的发酵生产项目三四环素的发酵生产

任务一四环素类抗生素基本知识四环素类抗生素是放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成四环素类抗生素。具有十二氢化并四苯基本结构。该类药物有共同的A、B、C、D四个环的母核，仅在5、6、7位上有不同的取代基。1.四环素类抗生素结构

四环类抗生素的结构

分类天然类金霉素、土霉素、四环素、地美环素（去甲金霉素）半合成类多西环素、美它环素、米诺环素等（1）光学性质：在350nm和265nm存在特征吸收峰。2.四环素类抗生素的理化性质（2）溶解性：两性化合物。

2.四环素类抗生素的理化性质呈酸碱两性C10–酚羟基、C3、C12–烯醇型羟基（弱酸性）C4–二甲胺基（弱碱性）

等电点pH=5.4（在等电点时，四环素呈游离碱的形式，溶解度最小）。在pH=4.5～7.2，四环类抗生素难溶于水。4＞PH＞8时，可得高浓度水溶液2.四环素类抗生素的理化性质不易溶于水，其盐水溶性也差，故不易配成注射液。能与各种酸、碱形成盐，盐酸盐最重要。（四环素、金霉素的理论效价以盐酸盐为标准，土霉素以游离碱为标准，1mg=1000U）（3）稳定性固体四环类抗生素在干燥、低温条件下较稳定。四环类抗生素的水溶液在不同pH值下的稳定性差别很大。一般在pH4～5左右较为稳定。酸性条件下反应1.脱水反应在酸性条件下，四环素类抗生素C-6上的羟基和C-5a上氢发生消除反应，生成无活性橙黄色脱水物。2.差向异构化反应在弱酸性（pH2～6）的溶液中，四环素C-4二甲胺基会发生可逆的差向异构化，生成差向四环素。差向异构化产物在酸性条件下还会进一步脱水生成脱水差向异构化产物。脱水产物及差向异构化产物抗菌活性均减弱或消失。差向异构化产物对细胞的毒性比四环素毒性增大70倍。碱性条件下反应在碱性条件下，由于氢氧根离子的作用，C-6上的羟基形成氧负离子，向C-11发生分子内亲核进攻，经电子转移，C环破裂，生成无活性的具有内酯结构的异构体。氧化剂四环类抗生素对各种氧化剂，包括空气中的氧气在内，都是不稳定的。碱性水溶液特别易氧化，颜色变深形成黑色。（4）形态颜色四环类抗生素都是黄色结晶性物质，在紫外照射下可产生黄色荧光。3.能形成螯合物与复合物四环素尿素四环素-尿素复合物四环素尿素四环素尿素四环素-尿素复合物四环素尿素（1）在碱性的溶液中，与金属离子形成螯合物沉淀，如：钙、镁、钡离子（吸收受乳制品及二、三价阳离子影响——配伍禁忌）。（2）与其他物质形成复合物沉淀，如：长烃链的季铵碱、尿素、氯化钙等复合物不溶于水；溶于有机溶剂，分离成四环素和尿素。作用机制：四环素能够与原核细胞中的16SrRNA

（30S核糖体的组成部分）结合，从而阻碍了氨酰tRNA与16SrRNA的结合，使得由mRNA到蛋白质的翻译过程无法进行。4.在临床上的应用广谱，细菌（除铜绿假单胞菌），螺旋体、支原体、立克次体、衣原体。抑制细菌生长、作用较弱（不及青霉素类或链霉素类）。耐药较严重急性毒性很低副作用多四环素生产采用合成金霉素的金色链霉菌菌种，通过在特定的培养条件下，控制产生菌的生物合成方向，使其产生95%以上的四环素。诺卡菌属、马杜拉放线菌属等也能产生四环类抗生素。5.生产菌种金霉素（7-Cl-四环素）四环素金霉素生产菌种－金色链霉菌，通过在培养基中加入抑氯剂和氯的竞争剂时，则能合成95％的四环素。金色链霉菌抑氯剂四环素NaCl金霉素金霉菌诱变育种采用的方法紫外线，氮芥、乙烯亚胺，放线素K等

1959年，刘颐屏利用基因重组技术并结合诱变因素处理，获得的金霉菌“重组2U-84”，发酵水平比出发菌株UK-81提高40％。同时还发现重组体菌株对诱变因素的敏感性增加，这样更有利于获得高产变种的机会。金霉菌的培养特征金霉菌在马铃薯葡萄糖等固体斜面培养基中生长时，营养菌丝能分泌金黄色色素，但其气生菌丝却没有颜色。孢子在初形成时是白色的，在28℃培养5-7d，