第四讲乳酸菌类型及生物活性次生代谢产物

第四讲乳酸菌及益生菌种类的功能及具有生物活性的次生代谢产物一、 1、 定义及分类乳酸菌生长特性及应用、产品开发二、 生物活性的次生代谢产物1、细菌素定义及种类特性Nisin是正常菌群中某些种类的乳酸乳球菌合成和分泌的一种对大多数G+菌有强大杀灭作用的细菌素。Nisin对养分细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚起Nisin已广泛应用于乳制品、罐头食品、高蛋白食品及饲料工业中。添加400IU/g114Nisin(一般在5-100mg/kg)，能对某些乳酸菌株有明显的抑制作用，造成菌株的活力下降、产酸受抑、生长不良，但乳酸菌总数变化不大。nisin乳链菌肽是由乳酸乳球菌产生的由基因编码的多肽抗生素，含有34个氨基酸残基，分子中含有5种稀有氨基酸，即氨基丁酸〔ABA、脱氢丙氨酸(DHA、β甲基脱氢丙氨酸DHB、羊毛硫氨基酸〔ALA-S-AL〕和β甲基羊毛硫氨基酸ALA-AB硫醚键形成五个内环。的抑制作用，对酵母和霉菌没有作用。迄今为止，乳链菌肽已在全世界约60多个国家和地区被用作食品防腐剂]。我国对乳链菌肽的争论始于1989年，中国科学院微生物争论所在国家自1992329日，我国卫生部食品监视部门签发了乳链菌肽在国内的使用合格证明1992101日实施的国标GB2760-86中的增补品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品的保藏中。乳链菌肽用于食品中的优点是安全无毒，它的LD50约为7000Kg，允许使用的最大剂量是33000IU/Kg，乳链菌肽是一种短肽，可以被体内的α-胰凝乳蛋白酶降解；不影响食品的色机理和毒性等进展了广泛的争论nisin菌株在发酵食品中的应用在干酪中的应用1951Hirsch等争论觉察nisin产生菌乳酸乳球菌乳酸亚种在Swiss型干酪中抑制厌氧产气芽孢的形成。nisin最早应用于干酪的防腐，也是目前乳制品应用中的一个主要方面。〔如肉毒梭状菌和厌氧的梭菌芽孢报道说，将nisin抗性株和nisin产生菌混合用于干酪发酵剂，可使优质产品率达90%以上，而用常规的方法仅有41%。学者们在这方面进展了大量的争论，nisin产生菌在干酪中应用的主要限制是生长缓慢和产酸率低。Exterkate等〔1976〕产酸率低主要缘由是缺乏蛋白酶系统。是这些nisinRoberts等〔1992〕用电穿空法将质pFG010C2nisin抗性和红霉素抗性，然后将其与nisin产生菌nisin失活。Roberts等〔1992〕nisin产生菌菌株获得一株自发突变的蛋白酶阳性菌株NCDO14041%的NCDO14040.5%JS102混合用于cheddar干酪发酵700IU/gnisin。此后，Roberts等〔1993〕nisin产生菌制作的干酪用于巴氏杀菌的干酪酱的一种配料成份，结果低湿度223722℃贮存时，延长了货架期。Berg〔1998〕Manchego成熟期间产nisinESI515对ListeriaInnocua60天后，产nisin的发酵剂发酵干酪中L.innocua比不产nisin104个。Rodríguez(2023)]等通过杂交的方法获得一株nisinTAB50Maisnier-patin〔1992〕其用于CamemberRodríguez〔1998〕[13]Manchego菌有良好抑制作用。使用产乳酸链球菌的作为发酵剂用于干酪的生产能到达抑菌的目的，其风味并未受到影响。Abdelghani等〔2023〕将nisin产生菌与其他乳酸菌用于HispßâniconisinnisinpH1Kg1.0gnisin45和游离氨基酸的数量分别是不加产nisin1.82.73-甲基-1-丁醛、丁二酮和乙酰甲基甲醇浓度增加，干酪风味更好。在泡菜中的应用Harris〔1992〕nisinNCK401nisinLeuconostocmesenteroidesNCK293L占主导地位，由于LL这种自然发酵主要信任于原料的微生物种群很难扩大生产并维持泡菜质量的稳定。乳酸乳球菌NCK401nisinL以外的其它微生物的生长，而不影响LNCK293100AU/mlnisin稍微抑制植物乳杆菌ATCC14917。600AU/mlnisin长。通过试验将乳酸乳球菌和L103:12%NaCl20℃发酵获得了较高质量。在酸奶中应用与干酪相比，nisin产生菌用于酸奶的发酵的争论应用较少，只有Kalra等〔1975〕争论nisin产生菌与其它菌株混合发酵来阻挡酸奶中酸的增加，以后他又争论了乳酸菌对nisin的敏感性，及nisin产生菌对其他一般发酵剂的影响。nisin产生菌在干酪中的应用已取得了可喜的成功，在泡菜和酸奶的应用中也有了初步的争论。到目前为止，还未见产nisin的乳酸乳球菌用于其他发酵食品中，假设将nisin产生菌与其他nisin抗性菌株用于发酵食品中，可以抑制其它不需要的微生物的生长，削减或不必nisin的菌株用于发酵食品中还未见报道。随着对nisinnisin的菌株在发酵食品中的应用必将大放异彩。2、乳酸菌胞外多糖的争论进展多糖是近年来兴起的一个争论热点，掀起了继蛋白质和核酸之后的又一生物大分子的得了不少进展，使得人们对它有了更深的了解〔2023。多糖是高度水合的聚合物，由重复单元〔由单糖组成〕以糖苷键链接而成，分为同聚多糖和杂多糖单糖上存在一些羟基，可以形成糖苷键，这就意味着任何两个单糖就可以以多种位置相连。及无几分子和有机分子的取代基，致使其构造尤为简单Robert199。由此可见，简单的多糖必定与简单的生命现象关系亲热。生物界中，动物、植物和微生物都是多糖的丰富来源。微生物的胞外多糖尤为重要。微生物多糖包括某些细菌、真菌和蓝藻类产生的多糖，主要以三种形式存在：粘附在细胞外表上；分泌到培育基中;构成细胞的成分。微生物多糖，因其安全无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注。微生物多糖包括胞外多糖是由微生物大量产生的多糖，易与菌体分别，可通过深层发酵实现工业化生产。据Ｄ.Ｅ.Ｅveleigh统计，已经觉察49属76种微生物产生胞外多糖,近几年,随着对微生物多糖争论的深入,世界上微生物多糖的产量和年增长量均在10%30%,已大量投产的微生物胞外多糖主要有黄原胶(Xanthangum)、结冷胶(Gellangum)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)(Curdlan)目前,很多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等。广泛应用于食品、50～100亿美元〔2023。近年来，人们越来越关注乳酸菌产生的胞外多糖，由于乳酸菌是公认的有益菌，所以它们产生的胞外多糖也具有GRA〔普遍认为是安全的DeVuysthe和Degeest199用能产生胞外多糖的乳酸菌发酵乳，即使只产生少量的胞外多糖〔60－400mg/，也可使发酵物具有粘稠的质地Cerning199。此外，胞外多糖还可以改善发酵乳的质地，使其质地象奶油一样光滑细腻Macura和Townsley1984，并且还能削减酸奶的乳清析出和胶体如免疫活性Odaetal.198。综上所述，乳酸菌胞外多糖具有很宽阔的进展前景。有关乳酸菌胞外多糖的物化特性及生物合成，争论者进展了深入探究，本文综述了这些方面的争论进展。乳酸菌胞外多糖的组成和构造乳酸菌胞外多糖是一个广义的概念，细分为荚膜多糖〔包围在菌体四周〕和黏质多糖〔释放都培育基质中的胞外多糖。目前争论的分泌胞外多糖的乳酸菌大多来源于乳制品，也有源于发酵肉的VanDenBergetal.199。常见分泌胞LbbulgaricuS.thermophilu、〔Lbcaseissp.case〔LbkefiranofacienLbacidophilu〔Lbsake0-〔Lclactisssp.cremori、乳酸乳球菌Lclacti〕和肠膜明串珠菌Leucmesenteroide。乳酸菌分泌的胞外多糖的特性与其构造和组成有很大的相关性。目前，争论者普遍认为由乳酸菌分泌的多糖是中性异型多糖〔即分泌到细胞壁或培育介质中的多糖分子量在0.5×1062×106之间，争论显示纯胞外多糖的溶液的黏度主要取决于其平均分子量〔VandenBergetal.,199。对各种乳酸菌分泌的胞外多糖的单糖组成争论说明，大多是由摩尔比例不同的葡萄糖和Cerningetal.1990,199〔Cerningetal.1986,198；Nakajimeetal.1990,1992；Gruteretal.1993；Grobbenetal.1995，甘露糖Petitetal.199MancadeNadraetal.198〔Cerningetal.1988,199，或者糖的衍生物，诸如N-乙酰半乳糖胺〔Docoetal.1990；Petitetal.1991〕和N-乙酰葡萄糖胺〔Cerningetal.1994。Arigaetal.〔1992〕分别出来一个完全不同的胞外多糖，由S.thermophilusOR901L-鼠李糖和D-1.00:1.47比例组成；Lact.caseiCG11产生的杂多糖组成主要是葡萄糖〔约占75〕和鼠李糖〔约占15Kojicetal.199，此外还有数量很少的半乳糖和甘露糖〔Cerningetal.1992EPS的单糖组成是不是胞外多糖溶液和发酵乳饮品的流淌学特性的影响因素大致不变。〔Sutherland,199争论显示胞外多糖是由分支的重复单元组成β1989到1990Docoetal.首次报道了由三株S.thermophilus分泌的胞外多糖的构造，觉察它是由D－半乳糖、D2－乙酰胺－2－脱氧－D2：1：1组成，其四糖重复单元的构造如下：→3〕－β-D－Galp－(1→3)－β-D－Glup－(1→3)－α-D－GalpNAC－(1→6↑α-D－Galp1Lemoine(1995S.thermophilusSFi12产生的胞外多糖构造，说明其含有一个六糖构造的重复单元，如下：→2-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glup-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4↑β-D-Galp1β-(1→2)为主链的葡聚糖，半乳糖和甘露糖具有肯定的抑制肿瘤的活性，而β-(1→3)为主链的葡聚糖，含有(1→6)支链的多糖，有的有抗肿瘤的活性，有的没有抗肿瘤的活性或者活性不高。〔顾瑞霞，2023〕要进一步的争论。乳酸菌胞外多糖的生物合成在很多状况下，细菌胞外多糖在毒性中起重要作用，由此驱动了有关细菌胞外多糖的生物合成的争论〔Roberts1995。因此，G〔-〕致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌和流行热嗜血杆菌等中的胞外多糖的生物合成就相对地明确。在这些G〔-〕致病菌中，根本重复单元首先在细胞膜上形成，接着二磷酸核糖前体被传送到异戊二烯脂载体上Sutherland2023糖，它既可以荚膜的形式共价结合到细胞外表，又可被释放到培育基质中作黏质。对乳酸菌合成胞外多糖所涉及的基因的争论，及与G〔-〕致病菌同源性的比较，都明确显示了这些菌合成胞外多糖的细胞机制与G〔-〕致病菌系统类似，都需要脂连中间体。Stingele等〔1999〕争论说明StreptococcousthermophilusSFi6中胞外多糖的生物合成需要一个脂载体，组成多糖的根本重复单元的单糖集合在这个脂载体上。第一步由1－磷酸半乳糖苷转移酶催化，将磷酸半乳糖连到磷酸脂载体上，随后其它三个糖苷转移酶催化，依次将N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖和一个分支的半乳糖局部连到上面。依次而论，乳酸菌胞外多糖的合成是一个耗能的过程，涉及很多酶，产生核糖前体，一个1-磷酸糖苷转移酶转移第一epsLamothe等2023G〔-〕和G〔＋〕菌合成胞外多糖所涉及的各种酶之间存在同源氨基酸，说明它们经受欠缺，仍有待进一步的争论。影响乳酸菌胞外多糖合成的因素EPS乳酸菌诸如S.thermophilusLb.bulgaricus内外的很多争论者对乳酸菌分泌胞外多糖的影响因素进展了大量争论工作多糖的力量受培育条件〔温度、PH值和培育基〕的影响很大。大多数产黏菌在全部生长条件都能分泌胞外多糖，但是分泌量最高却是在确定培育介质中，在特定的生长时期产生的Cowie,O.N.199质量以及掌握胞外多糖的生物合成尤为重要。有关增产因子对胞外多糖产量的影响存在很多冲突之处。Garcia-Garibay〔1991〕争论说明，当向培育Lb.bulgaricus的脱脂乳培育液中添加水解酪蛋白时，可以促进菌的生长和提高胞外多糖的产量，而Schellhaass〔1983〕争论指出，对于嗜热和嗜温的产黏菌来说，其生长和胞外多糖的分泌均与生长介质中存在的酪蛋白和乳清蛋白无关可是Cerning〔1986〕觉察酪蛋白能刺激 Lb.bulgaricus分泌胞外多糖，但不能促进菌体生长，也有报道说Lb.bulgaricus在乳和乳超滤液中分泌数量一样的胞外多糖当向超滤液中添加葡萄糖或蔗糖时可以促进菌体分泌胞外多糖。培育介质的PH值和温度均影响胞外多糖的合成〔Garcia-GaribayandMarshall1991。有关温度对产黏乳酸菌分泌胞外多糖的影响的争论报道也相互冲突最适生长温度范围内可以获得较大量的胞外多糖PHMozzietal.测得Lc.caseiCRL87分泌胞外多糖的最大量〔488mg/L〕PH值条件是保持在PH6.0。此外，在发酵中掌握PH值产生的胞外多糖的量要比不掌握PH3倍。近年来，随着生物技术的进展，有关产黏乳酸菌分泌胞外多糖的代谢途径和所涉及的A.Escalanteetal.〔1998〕争论说明产黏菌和不产黏菌之间的差异在于代谢途径中的焦磷酸化酶和差向异构酶在胞外多糖的合成中的作用不同术报道上存在的偏差有很多缘由，例如，检测胞外多糖的方法不同；承受不同的生长介质、条件和检测时间；缺乏PH值掌握；存在很多不同的胞外多糖产量的表达方式〔毫克EPS、mgEPS/mgEPS/CFFredrikLevanderetal〔2023〕归纳了S.thermophil

泌胞外多糖外多糖的产量时，必需成认的是EPS是一个耗能的过程，而乳酸菌仅有几条分解代谢途径EPS产量和生长相关，所以在努力显著提高EPS产量的同时应实行的方法提高菌体的生物数量Degeest等2023。乳酸菌分泌胞外多糖的生理作用产生胞外多糖的高能消耗和表观构造引起了人们对乳酸菌产生胞外多糖的作用的兴趣。细胞外表的多糖具有致病、共生、形成黏质和抗压的作用〔Robert,1995；DeVuyst2023为了储存能量，由于大多数的乳酸菌都不能分解代谢它们产的胞外多糖Cerning199。胞外多糖有在低湿环境中保护菌体的作用，由此Petersen〔2023〕调查了胞外多糖对嗜热链球菌MR-1C的菌数高于一般菌株，但差异并不格外显著。用产黏质多糖的嗜热链球菌外多糖存在与否更为重要Petersen2023。在全世界乳品工业中，致病性噬菌体是引起发酵失败的最重要缘由Moineau1999。人们认为胞外多糖具有保护菌体抵抗不良环境的作用证菌体免受噬菌体感染的的作用Kang和Cottrel197。可是，胞外多糖在乳酸菌受噬菌体感染的过程中所起的作用仍旧不清楚。一些争论说明胞外多糖有保护乳酸菌免受噬菌体感染的作用〔Vedamuthu和Neville，198Moineau199；DeVuyst和Degees，199。Looijesteijn等〔2023〕证明，与细胞相连的胞外多糖供给乳球菌属的很多菌株微弱的保护作用，抵抗噬菌体的感染。Forde和Firzaerald〔1999a〕也证明与一些乳球菌株松散相连的胞外多糖可以稍微抑制噬菌体的吸用Forde和Firzaerald1999Lamothe等2023〕试验证明保加利亚乳杆菌Lfi5具有噬菌体低敏感性。综合有关乳酸菌胞外多糖的报道得出，胞外多糖的单糖组成对噬菌体的敏感性无影响。体的感染。乳酸菌胞外多糖的遗传不稳定性由乳酸菌产生的EPS在基因水平上的不稳定性及其本身粘质特性的不稳定性始终以来都是乳品工业中的广为人知的问题Cerning,199。即使在最适生长温度，其产粘特性也会在传代几次之后消逝，并且消灭培育期延长Cerning,199；Macuraetal.,198必需定期地从发酵剂中从筛选产EPS的菌株，以保存其特性，用做工业菌株〔Stingele,等199。嗜温乳酸菌〔例如L.lactissubsp.Cremoris和Lactococcuslactissubsp.lacti〕产EPS的特性都常与质粒相关，遗传的不稳定性可用质粒的丧失来解释〔Macuraeral.,1984；Vedamuhu等,1986;Vescovo等,1989;onWright等198EPS却与质粒无关，由于这些菌中不含质粒Cerning,1990Vedamuhu等,198。由此推断，嗜热乳酸菌的EPS生物合成所需的基因似乎位于染色体上，遗传的不稳定性可能是由于遗现象均在德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌中观看到〔Germondetal.,1993;Rousseletal.,199。乳酸菌胞外多糖的应用SutherlandI.W.,199，Duboc和Molle2023酸菌生产各种有特色的发酵乳〔Cerning，199。乳品生产者也已经利用产胞外多糖的发酵菌株来掌握酸奶的乳清析出和胶体断裂源的稳定剂的国家，应用更为广泛〔Cerning，1995。应用产胞外多糖的嗜热链球菌生产低脂干酪，可以改善干酪的质地和功能〔Perryetal.,1995。随着对乳酸菌胞外多糖的更深入的探究，其应用范围会越来越广泛。3．共轭亚油酸〔CLA〕高产菌株选育共轭亚油酸〔Ｃonjugatedlinoleicacid，ＣＬＡ〕是一类在９与１１位，１０与１２〔９Ｚ，１２Ｚ—１８：２〕9Z11E—CLA和10E、12Z—CLA被认为是主要的活性形式，它是自然产物中主要的异构物，占来自反刍动物乳制品及肉制品中总CLA73%-93%。癌；抗糖尿病；免疫调整，增加机体免疫力；抗动脉粥样硬化；改善体质；增加肌肉，削减床，它的争论都具有重要的意义。ＣＬＡ主要是存在于反刍动物牛和羊等的肉和奶中。这是由于在反刍动物肠道中厌氧,主要是以ｃ-9,ｔ-11异构体形式存在。故自然的ＣＬＡ主要以反刍动物消化道的微生物代谢产物存在。Shantha等(1995年)觉察，CLA含量高于原料乳，当原料乳〔CLA4.4mg/kg〕加工成酸乳制CLA含量5.50mg/kCLAHaWhzCLA含量8.81mg/k〕较原料乳〔CLA0.83mg/kg〕CLA。AnejaMurthi报道，印度酸奶Dahi〔CLA26.5mg/kg〕也较原料乳〔CLA5.50mg/kg〕含有更多的CLA。以上说明微生物发酵作用提高了乳制品中CLA含量。ＣＬＡ也少量存在于其他动物的组织、血液和体液中。植物食品也含有ＣＬＡ,但其异构体的分布状况与动物食品显著不同。特别是具有生物活性的ｃ-9,ｔ-11异构体在植物食品中的含量很少0.1ｍｇ～0.7ｍｇＣＬＡ,且其中ｃ-9,ｔ-11异构体的含量少于50%。海洋食品中的ＣＬＡ含量也很少。有争论报道，每日推举摄入量从动物试验数据推想为3.5g/人/天。由此可见，向食物中强化CLA是有必要的。为了能够在工业上生产ＣＬＡ,,并且是可食用的；并且微生物生产的CLA特异性强，90%CLA9Z，11E—CLA。这是由于乳酸菌微生物中含有亚油酸异构酶,且其作用位点是在脂肪酸的Ｃ12双键上而不是Ｃ9双键上,能把亚油酸转化为ｃ9,ｔ11ＣＬＡ,而不是ｔ10,ｃ12或ｃ10,ｃ12异构体。空气对它没有影响,而有双键在Ｃ6上的脂肪酸会抑制其活性,但有双键在Ｃ9的共轭亚油酸可直接从细胞培育液中提取。目前还没有人对CLACLA的生理活性和食品中较低的含量，以及微生物生产的量也很少的状况下，通过育种找出高产菌株具有格外重要的意义。本课题的争论目的就在于查找高产CLA的菌株，使微生物生产CLA的方法到达产业化。国内外争论现状及进展趋势501966年C.R.Kepler觉察反刍动物乳汁中的CLA是由厌氧的瘤胃细菌如溶纤维丁酸弧菌〔Butyrivibriofibrisolvens〕等将亚油酸转化为CLA的，溶纤维丁酸弧菌的Δ12-顺-Δ11-反异构酶能够使亚油酸和亚麻酸转化成ｃ9,ｔ11-共轭亚油酸,然而由于此法有如下局限性而无法用于工业化生产：如亚油酸不仅仅转化成CLA，还会进一步氧化；溶纤维丁酸弧菌的培育需要格外严格的厌氧条件；它还具有使CLA复原成其他化合物的复原酶等1992年和1994Chinetal觉察老鼠肠道菌群有力量将亚油酸转化为CLA。1998年Jiang觉察常作为乳制品发酵剂的3种费氏丙酸杆菌〔Propionibacteriumfreudenreichii〕能在MRS培育基上厌氧的条件下将游离的亚油酸转化为CLA，最大量达265ug/ml。1999年，Pariza报道了一株乳酸杆菌〔Lactobacillusreuteristrain〕具有一种细胞膜结合酶，它能以亚油酸为原料，合成CLA。同年，TungY.Lin等人选取了嗜酸乳酸杆菌、保加利培育24小时后，觉察嗜酸乳酸杆菌〔Lactobacillusacidophilus〕的CLA产量最高，达105ug/ml。2023年，日本的科学家Ogawa等报道了嗜酸乳酸杆菌〔Lactobacillusacidophilus〕以LA为原料转化为CLA的过程不是从一个非共轭双键经一步异构化而成为一个共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，这是首次提醒LA到CLA的转化机制。同年，邵油酸