产前诊断人才细胞的细胞原位培养

产前诊断人才细胞的细胞原位培养

1973年，steele等人。1材料和方法1.1产前诊断指征选择2010年6-12月于广东省妇幼保健院优生门诊进行羊水产前诊断者1274人。产前诊断指征包括唐氏筛查高风险、高龄、不良生育史等。使用新型载片培养瓶(简称载片瓶)对1274例进行羊水培养,同时使用载片培养皿(简称载片皿)培养作为对照,即本实验室原培养法1.2方法1.2.1l弃去除除在超声定位、无菌条件下抽取羊水,最初2ml弃去后收集25ml,按照10、10、5m分装于3支无菌离心管。前2支随机分为研究组和对照组培养,第3支用于QF-PCR快速诊断。1.2.2实验材料Chang氏培养基,固定液,载片瓶(9cm1.2.3风导率的制备将2支10ml羊水1000r/min离心8min后,弃上清,加入Chang氏培养基8ml,摇匀后分别加入2个载片瓶,于37℃、5%CO1.2.4配套撬片器撬片时间g加入20μg/ml秋水仙素20μl,3h后去掉培养基,加入1%枸橼酸钠3ml,低渗时间按表1调整。预固定(甲醇:冰醋酸为3∶1)10min,后固定30min,共4次后即使用配套撬片器撬片,室内自然干片。60℃烤片过夜,次日G显带分析。对照组接种与收获按原方法进行1.2.5核分析根据产前诊断羊水染色体分析标准1.3统计分析采用SPSS17.0软件进行统计分析,非正态分布或末端无确定数值变量用中位数表示平均水平,组间比较采用χ2结果2.1成功培训2.2培养周期研究组培养时间5～8d,平均6.7d;对照组6～10d,平均8.9d,两组培养天数比较差异有统计学意义(χ2.3细胞克隆数研究组每个载片培养瓶细胞克隆数平均11.5个,对照组6.0个,两组细胞克隆数比较差异有统计学意义(χ2.4核型号的分析研究组每个克隆可分析核型数平均6.23个,对照组为6.27个,两组可分析核型数比较差异无统计学意义(χ2.5d患者选择学习时,其符合以下情况核型分析1274例,正常1225例,占96.15%;异常49例,占3.85%。镶嵌体34例,Ⅰ级水平25例,Ⅱ级水平7例,Ⅲ级水平2例(表5),其中真性镶嵌体3例。3个单、双体-单、循环在产前诊断的表现—讨论本研究对同一样本进行两组原位培养,成功率均达100%。但研究组在培养时间和细胞克隆数上优于对照组,可能原因为:(1)研究组中载片瓶与细胞悬液接触面积大,细胞容易分散生长;(2)载片瓶接种后无需加液,细胞更快更容易贴壁生长;而对照组接种后48h加液,细胞静置生长延长;(3)载片瓶设计的特点,加液速度快,收获后直接成片;对照组需逐滴缓慢加液按照产前诊断羊水核型分析标准镶嵌体是指同一个体里同时存在来源于同一个合子的2个或2个以上不同细胞系的现象关于镶嵌体的研究,国外分为三级:Ⅰ级水平:单个核型异常,常被认为是假性,不予报告。Ⅱ级水平:2个或以上核型发生相同异常,并局限在同一个原位培养皿,包括单个克隆的多个细胞异常,和2个克隆以上发生的异常,但这些异常在其他培养皿没有发现。这种Ⅱ级水平异常通常也被认为是假性镶嵌体,通常也不予报告。原因可能为母体组织污染、单个细胞不分离或合子后发生异常、未能识别的双卵双胎中异常的胎儿发生早期死亡后其滋养细胞残存等本研究产前诊断羊水镶嵌体中,Ⅰ级水平25例,占总数1.96%;Ⅱ级水平7例,占0.55%;Ⅲ级水平2例,占0.157%;母体组织污染1例,占0.078%,均低于国外研究经本研究发现,Ⅱ级中单个克隆异常的有6例,孕中期超声均未见异常;3个克隆相同异常的1例,结果为mos47,XXY[3]/46,XY[27],该例孕妇通过脐带血染色体分析结果mos47,XXY[7]/46,XY[43],最后选择引产。Ⅲ级的有2例,其中一结果为mos47,XY,+22[11]/46,XY[9],该例超声发现胎儿异常,包括法洛氏四联征、单脐动脉等,该孕妇选择引产;另一例结果为mos45,X[22]/46,XY[2],超声未见异常,建议进行胎儿脐带血分析,但最后孕妇由于个人因素还是选择引产。通过本研究,认为除了Ⅰ级与Ⅱ级中单个克隆异常不需报告以外,Ⅱ级中多个克隆异常与Ⅲ级均应该报告,以提示临床医生予以警惕。本研究病例Ⅱ级中尽管只有3个克隆,但是已经足够代表胎儿染色体发生异常。根据以往的经验,如果发现真性镶嵌体,应该及时进行超声检查。一般常染色体异常的多伴超声异常,如果性染色体则超声难以发现。此外由于羊水培养的细胞有限,不能诊断所有的真性镶嵌体,因此为了防止漏诊,应该对所有的哪怕是只有一个克隆异常的Ⅱ级镶嵌体保持警惕,因为这随时可能是来源于真性镶嵌体。对于这些假性镶嵌体研究则有待更进一步的追踪与随访。但是不得不警惕就是因为培养困难导致培养时间过长,细胞克隆数过少中由于母体滋养细胞的克隆化生长。本研究使用原位培养方法,目的是为了更好地解决羊水染色体中最让人困惑的镶嵌体问题。选择不同的培养容器,为的是增加细胞克隆培养,可以增加核型分析数量。当前,在产前诊断中尤其是羊水培养中发现镶嵌体的对策是重复抽取羊水,或者抽取胎儿脐带血进行染色体分析。国外曾有建议重复抽羊水进行间期原位荧光杂交技术,