金属-内酰胺酶最佳酶抑制物的选择

金属-内酰胺酶最佳酶抑制物的选择

近年来，随着内酰胺抗生素的广泛应用，从金属向内酰胺b型酶的细菌越来越多。它具有广的光谱特性、高效转坏的内酰胺抗生素和快速的耐药性，给抗生素的临床治疗带来了巨大困难，并引起了临床关注。11.1材料表面1.1.1培养头孢他啶的细胞菌收集微生物室日常送检临床标本,采用MicroScanautoSCAN4半自动微生物分析仪,NC21卡,完成各实验菌株的生化反应测定及抗生素敏感性试验,挑选出耐亚胺培南和(或)头孢他啶的铜绿假单胞菌,用小牛血清-80℃冰箱保存备用。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(产ESBLS菌株),铜绿假单胞菌ATCC27853均购自卫生部药品生物制品鉴定所,产金属β-内酰胺酶VIM-2、IMP-1、IMP-2型铜绿假单胞菌由香港中文大学威尔斯亲王医院惠赠。1.1.2微生物试剂和培养基半自动MicroScanautoSCAN4型微生物分析仪,NC21,M-H营养琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司,头孢他啶纸片(30ug/片)购自英国OXOID公司,Cucl1.1.3pcr扩增片段的合成溶菌酶、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶购自上海生物工程公司,检测引物:IMP-1(5’-CTACCGCAGCAGAGTCTTTGC-3’)、IMP-2(5’-GAACAACCAGTTTTGCCTTACC-3’),扩增片段594bp,VIM(5’-ATGGTGTTTGGTCGCATATC-3’)、(5’-TGGGCCATTCAGCCAGATC-3’),扩增片段为510bp,VIM-2(5’-AAAGTTATGCCGCACTCACC-3’)、(5’-TGCAACTTCATGTTATGCCG-3’),扩增片段为865bp,由上海生物工程公司合成,PCR产物测序委托中和科技发展有限公司完成。1.2方法1.2.1确定细菌的类型和药物敏感性试验以半自动MicroScanautoSCAN4型微生物分析仪进行。1.2.2金属-内酰胺酶基因检测煮沸法提取细菌总DNA后,用PCR法进行扩增金属β-内酰胺酶基因,扩增产物用电泳方法检测,总反应体系为50ul,25ul中含10～100ngDNA模板,MgCl1.2.3金属酶抑制根据NCCLS纸片扩散法,将质控菌株用生理盐水将菌株稀释成101.2.4金属酶检测用生理盐水将临床微生物送检标本中耐亚胺培南和(或)头孢他啶铜绿假单胞菌共100份稀释成1022.1最佳抑菌效果的酶抑制物筛选用8种酶抑制物检测质控菌株大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(产ESBLS菌株),铜绿假单胞菌ATCC27853,产金属β-内酰胺酶VIM-2、IMP-1、IMP-2型铜绿假单胞菌,评估出最佳抑菌效果的酶抑制物,结果见表1。从表中可见8种酶抑制物都有不同程度的抑菌作用,其中2-巯基丙酸对产IMP-1、IMP-2型金属酶的铜绿假单胞菌抑菌环大而清晰,且易判断,抑菌环直径增大均值分别为9.2mm、9.0mm,巯基乙醇和巯基乙酸也有较清晰结果,但比2-巯基丙酸抑菌环小,比金属盐化合物抑菌环大,EDTA对产VIM-2型金属酶铜绿假单胞菌抑菌环大而清晰,抑菌环直径增大均值为8.8mm,二乙烯三胺五乙酸也有较清晰结果,但比EDTA抑菌环小,比金属盐化合物抑菌环大。大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(产ESBLS菌株),铜绿假单胞菌ATCC27853抑菌环直径增大均值均小于2.0mm以下。2.2vm型金属酶检测使用引物IMP-1、IMP-2、VIM扩增100份耐亚胺培南和(或)头孢他啶铜绿假单胞菌的金属酶基因,共检出IMP-1型金属酶阳性3株,扩增出594bp左右条带,VIM型金属酶阳性6株,扩增出510bp左右条带,与预计目的片段长度相近,将VIM阳性株用VIM-2型引物进行PCR,结果亦为阳性,扩增出850bp左右条带,克隆测序的序列与GenBank公布的VIM-2基因序列(AY029772)一致,确认为VIM-2型金属酶。质控菌株产金属β-内酰胺酶VIM-2、IMP-1、IMP-2型铜绿假单胞菌金属酶基因检测全部阳性,大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC7006003(产ESBLS菌株),铜绿假单胞菌ATCC27853金属酶基因检测全部阴性。2.3微生物金属酶检测用优选出来的酶抑制物乙二胺四乙酸和2-巯基丙酸联合检测100份耐亚胺培南和(或)头孢他啶铜绿假单胞菌临床标本,结果见表2。从表中可见2-巯基丙酸检测IMP型金属酶抑菌环增大均值为8.8mm(扩大范围为6～12mm),VIM型金属酶抑菌环增大均值为5.2mm(扩大范围为2～7mm),用EDTA检测IMP型金属酶抑菌环增大均值为4.8mm(扩大范围为1～7mm),VIM型金属酶抑菌环增大均值为8.4mm(扩大范围为6～12mm),根据PCR金属酶阳性结果,将抑菌环直径增大为6mm定为金属酶阳性,若单用2-巯基丙酸检测金属酶,有可能漏检型VIM型金属酶,或单用EDTA检测金属酶的话,则有可能漏检IMP型金属酶,若两