临床分离革兰阴性菌的超广表型筛选及基因定位

临床分离革兰阴性菌的超广表型筛选及基因定位

随着大量使用三胺类抗生素-内酰胺钠，细菌对其耐药性也越来越严重。其中最主要的耐药机制是细菌产生能够水解β-内酰胺环的β-内酰胺酶,从而使该类抗生素失去活性,给临床抗感染治疗带来了极大困难,其中革兰阴性菌的耐药问题尤为突出。革兰阴性菌所产生的β-内酰胺酶分为4种:超广谱β-内酰胺酶(ESBL),头孢菌素酶(AmpC),碳青霉烯酶(其中包括金属酶)及耐酶抑制剂广谱酶(IRTs)。对临床感染革兰阴性菌进行β-内酰胺酶分型,有助于对细菌耐药性的变迁进行监测和分析,为临床合理用药及耐药菌的控制提供有价值的信息和依据11.1他啶、植物、克维酸酯类药品:头孢噻肟钠,氨曲南,头孢曲松钠,头孢他啶,克拉维酸。药物纸片:头孢西丁(FOX)纸片(Oxoid,30μg),亚胺培南(IPM)纸片(Oxoid,10μg)。1.2菌株菌株的分离临床菌株:南京东南大学附属中大医院2010～2011年临床分离,其中大肠埃希菌37株,肺炎克雷伯菌37株,枸橼酸杆菌17株,阴沟肠杆菌14株,鲍曼不动杆菌44株,产气肠杆菌36株,摩根菌属20株,铜绿假单胞菌44株。标准菌株:肺炎克雷伯菌1.3培养基胰蛋白胨大豆肉汤培养基,营养肉汤培养基,营养琼脂培养基,M-H肉汤培养基,M-H琼脂培养基(北京三药科技开发公司)。1.4仪器、检测方法冷冻离心机(Beckmancoulter),气浴恒温振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司),pH计(DenverInstrumentUltrabasic),PCR扩增仪(Bio-rad),电泳仪,MoleculerImagerChemiDoC22.1内酰胺酶菌的表型筛选2.1.1超广茉3430-内酰胺酶esbl菌的筛选根据CLSI标准采用肉汤稀释法进行表型筛选,用肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌株(1)培养物的稀释用M-H肉汤培养基将头孢噻肟钠,氨曲南,头孢曲松钠,头孢他啶分别进行一系列二倍稀释至终浓度为2μg/mL和1μg/mL,将待测菌株的营养肉汤培养物稀释至10(2)专酸终浓度的确定根据初筛结果得到的疑似产ESBL酶的菌株,用M-H肉汤倍比稀释配制头孢他啶和头孢噻肟终浓度为0.25～128μg/mL的10支试管,头孢他啶/克拉维酸和头孢噻肟/克拉维酸终浓度0.25/4～128/4μg/mL的10支试管,加入以同样方法稀释的待测菌液0.1mL,使终体积为2mL。35℃培养24h。2.1.2产头孢菌素酶抑制剂菌的筛选(1)头孢西丁药敏法采用K-B(Kirby-Bauer)纸片扩散法,将待测菌株制成0.5麦氏单位的菌悬液,并均匀涂布于M-H琼脂平皿表面,在平板中贴一张头孢西丁药敏纸片,35℃过夜培养。(2)表型确认测试在Coudron等推荐2.1.3亚胺培南胶片的使用采用EDTA协同试验,将待测菌株制成浊度为0.5麦氏单位的菌悬液,以棉拭均匀涂布于M-H平板上,在平板上贴两张亚胺培南纸片,两纸片相距4～5cm,在其中一张亚胺培南纸片的旁边约1.5～2cm处打一个3mmol/L的孔,滴加0.1mol/L的EDTA-Na2.2内酰胺聚吡咯的基因型证明2.2.1蘑菇由表型筛选实验筛选出的产β-内酰胺酶菌株。2.2.2pcr扩增模板的制备将待测菌株接种于2mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中,35℃振荡培养20h,取1mL培养物于13000r/min离心5min,弃去上清液,在沉淀物中加入500μL无菌蒸馏水,混匀,再置95℃电热恒温水浴箱中加热10min使细菌裂解,最后以13000r/min离心5min,去除细菌残渣,上清液即为扩增用的模板。2.2.3pcr反应系统和条件PCR反应在25μL体系的薄壁管中进行。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,引物设计见表12.2.4凝胶成像仪观察取5μLPCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析。凝胶为10μg/mLEB染色,结果用凝胶成像仪观察。使用DL1000DNAMarker(TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司)。33.1表中的结果3.1.1产esbl菌株的筛选结果表型初筛试验中头孢他啶,安曲南,头孢噻肟或头孢曲松的菌株生长浓度均≥2μg/mL,可提示此菌株疑似产ESBL。表型确证试验中与克拉维酸联合的药物MIC相对单独药物MIC降低≥3个倍比稀释度即可确定此菌株产ESBL。110株临床分离菌株经ESBL确证试验共检出产ESBL菌28株,总检出率为25.45%(28/110)。结果见表2。:PhenotypicscreentestforMBLanddidnotincludeaconfirmatorytest.3.1.2产头孢菌素酶型确证试验结果表型初筛试验中抑菌圈直径≤17mmol/L的菌株即疑似产AmpC酶。表型确证试验中在狭缝与抑菌圈的交界处出现扩大的细菌生长区,即确认此菌株产AmpC酶,见图1。161株临床分离菌株经AmpC确证试验共检出产AmpC菌29株,总检出率为18.01%(29/161)。结果见表2。3.1.3金属酶菌株的协同敏感区和稳定性EDTA旁的亚胺培南一侧出现抑菌圈效果增强或者两纸片间出现协同敏感区,即判定为产金属酶菌株,见图2。79株临床分离菌株经EDTA协同试验共检出产MBL菌36株,总检出率为45.57%(36/79)。结果见表2。3.2药基因检测结果用3种耐药基因型引物进行PCR扩增,根据电泳条带的位置判断菌株是否含有耐药基因。用ESBL耐药基因引物对28株表型筛选ESBL阳性菌株进行PCR扩增,其中所有28株皆为阳性;用AmpC耐药基因对29株表型筛选AmpC阳性菌株进行PCR扩增,其中25株为阳性;用MBL耐药基因引物对36株表型表型筛选MBL阳性菌株进行PCR扩增,其中30株为阳性(图3,图4,图5)。4对-内酰胺酶抑制剂的敏感性监测有关细菌产β-内酰胺酶的状况,对于了解细菌的耐药性有重要意义。ESBLs和AmpC酶报道较早,前者较常见于克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌,由质粒介导,水解第三代头孢菌素和单环类β-内酰胺抗生素,对碳青霉烯抗生素和头霉素类抗生素敏感,其活性能被克拉维酸抑制。质粒AmpC酶能够水解抗假单胞菌青霉素、第三代头孢菌素、氨基糖苷类和头霉素类抗生素,对第四代头孢菌素、氟