气相色谱法测定全血中的巴特妥

气相色谱法测定全血中的巴特妥

巴比妥药物通常用于镇静剂和安眠药。巴比特是巴比特常用的药物之一。有效血药浓度为15g。ml，高于100g。如果你服用5.10克，你会死于中毒。死亡的血药浓度约为34160g/ml。1材料和方法1.1涡流混合器型气相色谱仪(GC-2010型,附带氢火焰离子化检测器(FID)和色谱工作站GC-solution,日本岛津公司),高速台式离心机(TGL-16C型,上海安亭科学仪器厂),漩涡混合器(VDRTEX-5型,海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。巴比妥标准品(中国药品生物制品检定所,批号:171220-200602),苯巴比妥标准品(中国药品生物制品检定所,批号:171222-200605),巴比妥钠(分析纯,天津市科欧密化学试剂有限公司,批号:Q/12HB3592-2002),无水乙醇[分析纯,重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂,批号:20001016],偏磷酸[分析纯,重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂,批号:20070424],实验用水为Milli-Q超纯水(>18MΩ·cm)。1.2工作液的配制室温下精密配制10mg/mL巴比妥乙醇溶液,5mg/mL苯巴比妥乙醇溶液,密封于4℃冰箱内保存,临用时稀释成系列工作液。分别精密称取巴比妥标准品和苯巴比妥标准品100mg和50mg,置10mL容量瓶中,用乙醇溶解并定溶,得10mg/mL巴比妥标准储备液和5mg/mL苯巴比妥内标储备液,贮存于4℃备用,临用时稀释成系列工作液。1.3进标、管压、空气温度色谱柱:AEOV-1701毛细管柱(50m×0.25mm×0.33μm),程序升温:柱起始温度180℃,保持1min,以30℃/min的速度升至260℃,保持15min;进样口温度:270℃;检测器温度:280℃;载气:氮气,纯度不小于99.99%;柱前压:227.8kPa;柱流量:1.5mL/min;隔垫吹扫流量:3mL/min;空气:300mL/min,氢气:30mL/min,尾吹气:30mL/min;分流比:100∶1;进样量1μL。1.4样品采集与预处理1.4.1巴比妥钠水溶液配制正常SD雄性大鼠(338g,来源于贵阳医学院实验动物中心)灌服4mL浓度为15mg/mL巴比妥钠水溶液(临用时配制),6h后心脏采血,装于密闭抗凝管中,-20℃保存。1.4.2苯巴比妥乙醇溶液、监管剂溶液取血液样品0.5mL,置2mL聚丙烯离心管中,加入5mg/mL苯巴比妥乙醇溶液50μL、无水乙醇0.5mL、5%偏磷酸溶液0.5mL,漩涡混合器混合5min,4000r/min离心5min,取1μL上清液进样。2结果2.1样品预处理方法各取0.5mL空白血液分别装于3支2mL聚丙烯离心管中,其中一管作为空白阴性对照,一管加入250μg苯巴比妥溶液,另一管加入200μg巴比妥溶液和250μg苯巴比妥溶液,按“1.4.2”的样品预处理方法制备供试液,各取1μL进样分析。结果显示,溶剂峰、巴比妥峰和苯巴比妥峰的保留时间分别为2.28、5.54和10.89min,三者峰完全分离,且巴比妥峰与苯巴比妥峰的保留时间相近,空白无干扰,满足定量分析要求。色谱图见图1~3。2.2线性范围考察根据实际工作需要,拟设大于5倍中毒剂量为线性上限,考察血液中巴比妥质量浓度在0~500μg/mL之间的线性关系,制备每毫升血液含0、5、10、40、80、200、500μg巴比妥的样品,分别按“1.4.2”的方法操作,以巴比妥浓度值为X轴,巴比妥与苯巴比妥峰面积比值(A巴比妥/A苯巴比妥)为Y轴,得回归方程:y=0.0014x-0.0003,r=1.0000。结果表明,血液中巴比妥质量浓度在0~500μg/mL范围线性良好。另制备12份每毫升血液含5μg巴比妥的样品,按“1.4.2”的方法操作,计算巴比妥与苯巴比妥峰面积比值(A巴比妥/A苯巴比妥)的标准偏差,再根据3倍信噪比计算,得此方法的检出限为1.6μg/mL,小于巴比妥的治疗有效血药浓度,可满足实际鉴定需要。2.3方法回收率和精密度结合临床诊断与司法鉴定实际检测需要,在线性范围内,拟设小于治疗浓度、大于中毒浓度和线性上限浓度3个回收率和精密度考察点,制备血液中巴比妥浓度为10、80和500μg/mL的样品,按“1.4.2”的方法操作,每一浓度每天平行测定6份,以当天巴比妥的相对校正因子计算得实测浓度,与样品浓度比较,计算方法回收率,并获得日内精密度,连续测定5d,获得日间精密度。结果表明,本方法回收率为96.5%~104.0%,日内精密度和日间精密度均小于10%,符合定量检测方法学要求。结果见表1。2.4回收率、精密度与稳定性制备低、中、高3种浓度的血液样品,分别考察在室温密闭放置8h、-20℃密闭保存30d(期间反复冻融3次)和血样按“1.4.2”的方法操作处理后常温密闭放置8h的稳定性,每个稳定条件平行测定5份。结果表明,在上述稳定条件下,回收率为97.0%~102.0%,精密度小于10%,血液样品在室温、长时间冷冻并反复冻融情况下稳定性均较好,能满足样品储存需要;样品处理后的供试液在8h内稳定,能满足正常检测时间需要,可同时处理多批样品。结果见表2。2.5测定巴比妥的含量分别取0.5mL空白血液和“1.4.1”制备样品各3份,其中每份空白加入250μg巴比妥标准溶液,按“1.4.2”的方法操作,测定巴比妥的相对校正因子及样品中巴比妥的含量,测得样品中巴比妥的含量为209.34μg/mL,相对标准偏差为4.3%,方法重