上海地区医院鲍曼不动杆菌耐药性及-内酰胺酶基因携带情况研究

上海地区医院鲍曼不动杆菌耐药性及-内酰胺酶基因携带情况研究

非动菌是医院感染的常见病原体。该菌广泛存在于自然界、医院和人体皮肤，为常见条件下的抗病性。鲍曼不动杆菌主要引起医院获得性肺炎、败血症、尿路感染、伤口感染、脑膜炎以及免疫受损、术后患者感染。鲍曼不动杆菌对许多抗菌药物,如β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类均有一定的耐药性,但近年来由于抗菌药物在临床过度使用,鲍曼不动杆菌耐药性呈上升趋势,尤其是出现了碳青霉烯类耐药菌株,给临床治疗带来很大挑战材料和方法一、材料表面1.患者标本来源收集上海4家医院临床分离的鲍曼不动杆菌共204株,其中东方医院33株(2010年8、9月份标本),公利医院13株(2010年7、8月份标本),仁济医院东院102株(2010年2至10月份标本),瑞金医院26株(2010年10月份标本),仁济医院西院30株(2010年10月份标本),标本分别来自痰液、引流液、尿液、血液、脑脊液、脓液、咽拭子、胆汁、插管等,去除同一患者重复标本。所有菌株经VITEK-32细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)鉴定。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)。2.抗菌药物及抗菌试剂阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢西丁、头孢哌酮、他唑巴坦、舒巴坦、磺胺甲口恶唑、甲氧苄啶、美罗培南、多黏菌素B等抗菌药物制剂购自上海科佳药检器材公司。头孢吡肟由中美上海施贵宝制药有限公司惠赠,亚胺培南由默沙东制药有限公司惠赠,哌拉西林由华山医院抗生素研究所惠赠。3.试剂TaqDNA聚合酶、10×聚合酶链反应(PCR)缓冲液(含MgCl4.仪器二、方法1.患者抗菌药物mic用琼脂稀释法检测204株鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的MIC。试验方法及结果判断标准参照2009年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判断药敏结果2.表型阐明了阐明阐明酶的方法参照Coudron等3.亚胺培南药敏纸片的安装按照纸片扩散法药物敏感性试验操作规程,将细菌配成0.5麦氏单位浓度,均匀涂布在MH琼脂平皿上,分别贴2张亚胺培南药敏纸片,2张纸片中心相距>25mm。在其中1张纸片上滴加5μL500mmol/L(pH值8.0)EDTA溶液。35℃培养20h观察结果。亚胺培南+EDTA纸片与单纯亚胺培南纸片的抑菌圈直径之差≥7mm为金属酶阳性4.细菌悬液的制备用煮沸法提取质粒DNA:从MH平板上挑取3~4个菌落于300μL0.85%的生理盐水中,制成细菌悬液,混匀。5500×g离心5min,弃上清,加300μL无菌双蒸水,混匀。细菌悬液100℃水浴,15min后离心,7900×g离心2min,取上清液即为DNA模板。5.pcr扩增总反应体系为50μL,其中10×缓冲液(含MgCl6.序测量结果一、抗菌药物耐药结果4家医院的菌株对环丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦、头孢西丁、复方磺胺甲口恶唑、头孢哌酮耐药率均较高,达到90%以上,其中对头孢西丁耐药率最高,对左氧氟沙星、多黏菌素B耐药率均相对较低,对多黏菌素B尤其敏感。其中浦东地区3家医院鲍曼不动杆菌对美罗培南、左氧氟沙星、多黏菌素B的耐药率均显著高于浦西地区医院,见表1和表2。二、3d试验的结果公利医院AmpC酶表型阳性率最高(84.6%),瑞金医院的AmpC酶表型阳性率最低(42.3%),见表3。三、da型阳性菌株公利医院和仁济医院西院未检测出金属酶表型阳性菌株,另外3家医院中以东方医院检出率最高(27.3%),瑞金医院检出率最低(7.7%),见表4。四、oxa-53、oxa-53、imp-2和tim-2基因检测结果浦东地区医院OXA-23阳性率较浦西地区医院阳性率高。浦东地区医院ampC阳性率比浦西地区医院高。204株菌株OXA-51均为阳性,均未检测到OXA-24、OXA-58、IMP-1基因,仁济医院东院和东方医院检测到IMP-4和VIM-2基因,并且出现了IMP-4和VIM-2基因同为阳性的菌株,公利医院、瑞金医院、仁济医院西院未检测出IMP-4和VIM-2基因,见表5、表6。五、genba基因同源性分析将PCR扩增产物纯化后进行测序,测序结果经Blast比对,OXA-23、OXA-51、ampC、IMP-4、VIM-2与GenBank相关基因同源性分别为100%、99%、99%、100%、100%。内酰胺酶基因型检测鲍曼不动杆菌是引起医院感染的常见病原菌,其耐药性强,耐药谱广,对多种抗菌药物耐药。临床上亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物是治疗鲍曼不动杆菌感染的有效药物,但鲍曼不动杆菌对这类抗菌药物的耐药率也逐年上升。本研究对上海不同地区的鲍曼不动杆菌耐药性检测发现,菌株同时对氨基糖苷类、喹诺酮类、头孢菌素类、磺胺类等抗菌药物耐药性较高,对多黏菌素B敏感,含酶抑制剂头孢哌酮-舒巴坦的抑菌效果略优于单独头孢哌酮,这与之前学者研究结果较一致A类酶,主要是超广谱酶,如SHV、TEM、PER、CTX等。B类酶,称为金属β-内酰胺酶,对β-内酰胺类抗菌药物具有广泛的水解作用,目前认为鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制中最重要的是产金属β-内酰胺酶,这类酶活性主要依赖二价锌离子,故称金属酶,是碳青霉烯酶的一种。该酶广泛水解多种β-内酰胺类抗菌药物,对常用β-内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦等)不敏感,但其活性可被金属螯合剂(如EDTA)抑制。近年来,金属β-内酰胺酶在世界范围被广泛发现,逐渐成为研究热点,金属酶以IMP、VIM型为主且可分为多种亚型,此外还包括SPM、GIM、SIM型等多种类型。本研究结果显示,仁济医院东院和东方医院的鲍曼不动杆菌基因检测出金属酶阳性,说明这2家医院的耐药机制中包括产金属酶。在本研究中表型检测阳性率高,而PCR检测阳性率却较低,结果相差较大,国内学者也有相似结果报道C类酶,即AmpC酶,主要分解三代头孢菌素及单环酰胺类,可被氯唑西林、Syn2190抑制。诱导性产AmpC酶的革兰阴性菌有较高频率的自发突变D类酶,又被称为苯唑西林酶本研究检测出浦东地区医院存在IMP-4基因和VIM-2基因,之前产金属酶鲍曼不动杆菌在浦东地区医院中鲜有报道,金属酶基因在浦东地区医院中出现,提示各个医院须严格管理本院碳青霉烯类抗菌药物的使用,防止多重耐药鲍曼不动杆菌传播,而本研究只检测了5种金属酶基因型中以IMP、VIM为主的2种,也可能存在其他3种基因型及其他亚型,这都还有待进一步试验研究。通过对仁济医院近年来的细菌耐药性分析,发现近年来头孢类和碳青霉烯类耐药