ELISA测定操作中的注意事项

ELISA测定操作中的注意事项一、标本的收集和保存激素和治疗药物测定的血清标本，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。二、可能影响测定结果的标本因素内源性因素：类风湿、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、交叉反应物质等RF：在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的RF,—般为IgM型，在ELISA测定中，可与固相上包被的特异性IgG以及随后加入的酶标特异性IgG结合，出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异性抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人|J链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。为避免RF对ELISA的干扰，可采取以下措施：稀释标本：急性病原体感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度很高，而RF滴度通常相对要低得多。因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。改变酶标抗体：由于RF结合的是IgG的FC片段，如果将待标记的抗体的FC段酶切去除，仅留下具有特异结合功能的F(ab")2标记酶，则在测定中可避免RF的干扰。标本中RF用变性IgG预先封闭：将经热变性(63°C,10min)的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中测定抗原时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂如1-巯基乙醇，使抗体内的巯基裂解，因而可以去除RF的干扰包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体IgY：RF不与鸡IgY反应。补体固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其FC段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，引起假阴性结果或使定量测定结果偏低。措施：加热56C30min使标本中补体灭活；包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体(不激活人的补体系统)异嗜性抗体：可通过交联固相和酶标的单抗或多抗出现假阳性反应(主要是可与山羊、小鼠、大鼠、马、牛的IgG的Fab区域结合，但不与兔IgG的Fab区结合)措施：使用特异的兔F(ab")2片段作为固相或测定酶标抗体；在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。溶菌酶：溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。Ig等电点约为5，故在双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接，导致假阳性。因此，为保证ELISA测定的可靠性，有必要从标本中去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+和卵白蛋白可有效封闭溶菌酶，防止其连接IgG。外源性干扰因素：1•标本溶血：血红蛋白中含有血红素基团，类似过氧化物酶的活性，因此，在以1RP为标记酶的ELISA测定中，如标本中Hb浓度较高，很容易在温育过程中吸附于固相，从而与其后加入的HRP底物反应显色。标本被细菌污染：细菌分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用，一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的B-半乳糖苷酶本身会对相应酶做标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在2-8C下保存时间过长IgG可聚合成多聚体，在间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。标本凝固不全血液通常在采集半小时后开始凝固，18-24h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时离出的血清并非完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在测定中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。5．冷冻保存标本避免反复冻融标本反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果三、试剂准备临床实验室通常在实验时将试剂从冰箱中拿出即用，忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此，应将试剂先从冰箱中拿出来在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。四、加血清样本及反应试剂加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性；加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应界面有差异。五、温育温育是ELISA测定中影响成败最为关键的因素。温育所需时间与温度成反比。最为常用的温育温度有37°C和室温，其次是43°C和2-8°C。目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37°C0.5-1h，进口ELISA试剂盒通常为37C1-2h1．要保证在设定的温度下有足够的反应时间：通常将微孔板一放入温箱即开始计时，而孔内温度从室温升至37C需要一定的时间，这样很容易造成在实际测定中温育时间不够，弱阳性标本测不出来。2．温育温度的选择：从免疫测定的抗原抗体反应的本质看，在较低的温度下、较长的时间反应最为完全。较高的反应温度，由于分子运动的加快，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。3．边缘效应的排除：边缘效应即外周孔显色较中心孔深，产生原因可能是外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。将板和溶液均加热至温育温度，可和容易排除边缘效应。五、洗板六、显色一般商品试剂盒中，以TMB为底物，提供A和B两种应用液；以OPD为底物，则提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。显色条件为37C15-30分，理论上说37C30分才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分内，绝大部分催化反应可完成，但弱阳性标本可能未充分显色。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行七、比色以TMB为底物时，比色波长为450nm；以OPD为底物时，比色波长为492nm单波长或双波长比色的选择:单波长是使用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而双波长则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板孔上诸如指纹、灰尘、赃物等所致的吸收，因此，在ELISA比色测定中最好使用双波长，且不必设空白孔。八、结果判定定性测定的“阴性”和“阳性”判定依据是试剂盒所确定的阳性判断值Cut_off),定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线(又称标准曲线)常用的缩写：S/CO：S为sample(样本)或specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为cut_off值的简写。当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。S/N或P/N：其中S同上，N为negative(阴性对照)的简写，P为patient(患者)的简写。较早试剂盒多使用S/N或P/N22.1为阳性判定标准。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照(N)的2.1倍视为cut_off值而已。ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因：1．弱阳性质控样本检测不出：温育时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。2．测定的重复性差(相同样本两次测定结果不一致)：这是典型的由测定操作所引起的问题，包括(1)加样及试剂量不准，孔间不一致；(2)加样过快，孔间发生污染；(3)加错样本；(4)加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；(5)不同批号试剂盒中组分混用；(6)温育时间、洗板、显色时间不一致；(7)孔内污染杂物；(8)酶标仪滤光片不正确