定点突变技术课件

定点突变技术

定点突变技术1基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等根据其特点可将基因突变技术分为两大类：位点特异性突变定点突变随机突变基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等2

定点突变的研究意义1对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系

2对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用。获得突变蛋白。定点突变的研究意义1对调控区进行突变3位点特异性突变的类型寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。PCR介导的基因突变位点特异性突变的类型寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的4定点突变技术ppt课件5Kunkel

法

在E.coli中

dUTPdUMP

在dUTP酶缺失体中（dut-

）

dUTPdUMP

在正常情况下，尿嘧啶－Ｎ－糖基化酶(ung-)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。因此在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级原理Kunkel法在E.coli中在6定点突变技术ppt课件7定点突变技术ppt课件8Kunkel

法小结用此种方法产生的突变体不必利用核苷酸探针标记来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样就免除了繁杂的杂交程序。此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。（可用含有目标基因的M13双链DNA

载体感染E.coli

CJ236品系，其为dut-

ung-

菌株）Kunkel法小结用此种方法产生的突变体不必利用核9Oligo诱导突变的改进方法武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导突变方法进行了改进。2-3个核苷酸替换的突变频率可达80%-85%，即使是需要有道连续4个氨基酸缺失，突变频率也高达40%－５０％。Oligo诱导突变的改进方法武汉大学的叶林柏等人对Oligo10原Kunkel法改进后的方法DNA聚合酶和T4连接酶同步加入分级退火，冰浴稳固异源双链再加T4连接酶直接用反应混合物转染经酚-仿抽提后再进行转染转染效率：3个空斑转染效率：78个空斑原Kunkel法改进后的方法DNA聚合酶和T4连接酶同步11定点突变技术ppt课件12PCR介导的基因突变在基因5’和3’末端产生突变重叠延伸PCR大引物PCR法PCR介导的基因突变在基因5’和3’末端产生突变13定点突变技术ppt课件14定点突变技术ppt课件15重叠延伸PCR法小结缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛

同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变重叠延伸PCR法小结缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且16定点突变技术ppt课件17定点突变技术ppt课件18定点突变技术ppt课件19各种方法的比较寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优点保真度高简单易行突变效率高操作简单突变成功率高缺点操作复杂周期长合成多条引物成本高受到酶切位点的限制后续工作复杂TapDNA聚合酶保真性偏低各种方法的比较寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优20应用一步反向PCR法Stratagen公司的Quickchange试剂盒应用一步反向PCR法21定点突变技术ppt课件22一种简便快速的定点突变的方法Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DN