应用蛋白组学技术对肾错构瘤尿液差异蛋白的研究

应用蛋白组学技术对肾错构瘤尿液差异蛋白的研究

近年来，蛋白质指纹是一种开发的新蛋白质组学技术。在肿瘤发育过程中，我们可以捕捉血浆蛋白分子的微变化，为肿瘤做一个非常早期的诊断。1数据和方法1.1标本采集和处理肾错构瘤组:2010年3~5月期间采集标本共计14例,男3例,女11例,年龄28~67岁,平均48.5岁。所有患者术后病理检查均确诊为肾错构瘤。对照组:采集正常对照组标本共计10例,均为男性志愿者,年龄25~32岁,平均28.7岁。所有志愿者均体检健康,尿常规检查完全正常。采集前晚空腹禁食水,晨起采集二次清洁中段尿。采集后将尿管置于冰壶中,迅速送至实验室以2000r/min速率离心5min,吸取上清液,分装于Eppendorf管中,每管200μl,每例3管,置于-80℃低温冰箱中冻存。从采集尿液到样本冻存在30min之内完成。1.2标准品点样的制备尿液样本准备:从-80℃冰箱中取出尿液样本,取尿液30μl加入含磁珠和磁珠结合液的样品管中,用加样枪上下吸打混匀至少5次,避免起泡,吸打混匀后室温静置备用。弱阳离子磁珠准备:200μl样品管加入10μl磁珠结合缓冲液,再加入10μl磁珠并吸打混匀。向样品管中加5μl尿液并吸打混匀。将样品管放入磁珠分离器,分离后吸去悬浮的液体。样品管中加入100μl磁珠清洗缓冲液,分离后吸去悬浮的液体。重复上述步骤两次,以保证悬浮液完全被吸走。向样品管中加入5μl磁珠洗脱缓冲液,然后放入磁珠分离器。磁珠与悬浮的液体充分分离后,将上清液移入新的0.5μl样品管。向样品管中加入5μl磁珠稳定缓冲液并吸打混匀。标准品点样:室温溶解标准品,取1μl标准品与10μl基质混合。取1μl混合液点在Anchorchip靶标准品位置,室温干燥。将Anchorchip靶放入质谱仪,采集分子量范围1~13000。同一标准品结晶靶点、不同结晶点多点采集,累加5~10个结晶点数据,得到累加后的标准品图谱,平均分子量偏差小于100ppm。尿液样品点样:取磁珠处理后的样品,取1μl点在Anchorchip靶样品位置,室温干燥。采用美国Autoflex1.3分子量校正方法根据整体波形特点,剔除不合格图谱,并对低分子量区间波峰分子量进行校正。采集分子量区间范围为1~10000,选择标准品进行分子量校正。标准品质谱图谱见图1。利用ClinProTools2.2软件对质谱图的数据进行分析,筛选尿液差异蛋白峰,建立肾错构瘤尿液的诊断模型。2结果2.1农村地区罪犯以生产国家为主体的基本组织、数的n.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.4.5.4.5质谱仪采集分子量区间1~10000范围内全部可识别蛋白峰124个(图2),具有显著性差异的蛋白峰41个,分子质量为4270.15、2251.62、1635.26、8106.63、9303.62、4255.74、6263.33、6432.12、7770.59、1884.62、2049.95、5310.47、6076.51、2755.27、2268.46、6335.49、1863.73、2159.63、6129.79、6061.49、5907.25、6634.46、8854.21、7614.12、1562.68、4046.78、5419.37、6096.98、6030.13、6390.52、2902.46、1578.73、4658.19、1892.33、1535.33、3406.3、2562.16、3725.53、5216.72、7904.17、5232.45(P<0.05)。凝胶模拟示意图见图3。2.2遗传算法的诊断模型利用ClinProTools2.2软件通过遗传算法优化选择,筛选出符合条件的12个差异蛋白峰建立诊断模型(表1)。交叉验证后,诊断识别能力为91.67%。3探索肾错构瘤中示负的脂肪成分maldi-tof-ms技术肾错构瘤是肾良性肿瘤中最常见者,约占肾肿瘤的3%。部分患者可同时有结节性硬化症,此系常染色体显性基因导致的遗传的家族性疾病,我国错构瘤绝大多数并不伴有结节性硬化。肾错构瘤80%为女性,出现病状在20~50岁,40岁以后占多数。肿瘤组织由血管、平滑肌和脂肪组成,其典型影像学表现为超声提示强回声脂肪密度,CT提示负值的脂肪成分MALDI-TOF-MS技术是在传统的2D凝胶电泳技术之后发展起来的蛋白质组学新技术。本文采集的差异蛋白峰分子量范围在1~10,结果中许多在统计学上有显著差异的蛋白质分子量在5000以下,而经典蛋白质组学2D凝胶电泳技术能够分辨的最小分子量多在4000~5000以上。因此,MALDI-TOF-MS技术在寻找小分子量差异蛋白上的优势明显,其简单、快速、高纯、高收率等优势适合于临床实际应用本课题首次应用WCX磁珠联合MALDI-TOF-MS技术和ClinProTools2.2软件,筛选出肾错构瘤组与对照组之间多个尿液差异蛋白。WCX磁珠联合MALDI-TOFMS技术可以作为影像学诊断的有益补充,提高肾错构瘤的诊断率。本课题首次应用遗传算法,建立前列腺癌与对照组之间尿液差异蛋白的诊断模型。遗