基因工程的载体和工具酶课件

1第二章基因工程的载体和工具酶第一节载体11第二章基因工程的载体和工具酶12引言

基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。---(在低等生物中复制的要求）⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。（是否为生物生存必需的？）⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。⑷自身分子量较小，拷贝数高。⑸在宿主细胞内稳定性高。(6)无害性：对于载体（不能超片段长度限制）和宿主。22引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增3CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene33Characteristicsofvectorsfo载体的分类一、病毒载体和非病毒载体非病毒载体：质粒噬菌体载体黏粒载体人工染色体二、克隆载体和表达载体克隆载体是以保存基因为目的的载体三、游离载体和整合载体四、穿梭载体P104载体的分类一、病毒载体和非病毒载体质粒二、克隆载体和表达载体5一、质粒载体（plasimidvectors）（一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备

（三）质粒载体的改造55一、质粒载体（一）质粒载体的生物学特性56（一）质粒的生物学特性（1）质粒的组成与构型质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA）

DNA分子。广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。66（一）质粒的生物学特性（1）质粒的组成与构型广泛从在于细菌7质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种双螺旋共价闭合环（SC构型）开环双螺旋（OC构型）线状双螺旋（L构型）77质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种双螺旋共8ocLcscSc超螺旋Lc开环线性Oc开环双螺旋

88ocLcSc超螺旋Lc开环线性O9（一）质粒的生物学特性（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。有的可以在两种宿主中穿梭，可以构建出“穿梭载体”。99（一）质粒的生物学特性（2）质粒的大小差异很大，最小的只有10（一）质粒的生物学特性（4）质粒的复制既然质粒在宿主中能稳定维持，不会随着细胞的分裂而消失，表明质粒有自我复制和正确分配到子细胞的功能。cop复制基因阻遏物质粒不会无限制复制1010（一）质粒的生物学特性（4）质粒的复制cop复制基因阻遏一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigentplasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为10以上。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。质粒的复制不需要自身编码蛋白质，利用的是细菌编码的蛋白质，这种蛋白质的半衰期较长，因此利用抑制蛋白质合成的药物（如氯霉素）可以造成质粒在细菌内的积累。氯霉素处理细菌后，松弛型质粒的拷贝和严紧型质粒的拷贝数都会增加么？11一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将（5）质粒的不亲和性把能寄于同一细胞内的不同质粒称为亲和性质粒，不能寄于同一细胞内的质粒称为不相容性质粒或不亲和性质粒。当质粒承载外源基因转入受体时就要考虑转入的质粒与外源质粒的亲和性。？不亲和的机制尚没有圆满的解释，但认为与inc基因有关，inc基因调节内源质粒的复制。成熟的细胞中内源的质粒都处于稳定的饱和状态，因此，亲缘密切的质粒引入细胞中也不会复制，最后消失。12（5）质粒的不亲和性当质粒承载外源基因转入受体时就要考虑转安全？⑹质粒的转移

13（一）质粒的生物学特性分子量大严紧型复制

分子量小松弛型复制

是否含有接合转移基因

非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：接合型质粒非接合型质粒13安全？⑹质粒的转移

（7）质粒的筛选标记

氨苄青霉素抗性ampr

，四环素抗性tetr，卡那抗性kanr，这些可以在细菌中使用，在真核生物中一般用潮霉素抗性hphr，卡那kanr也可以用作真核细胞的筛选标记。营养缺陷型的应用插入失活和α互补。（一）质粒的生物学特性14（7）质粒的筛选标记（一）质粒的生物学特性1415（二）质粒DNA的制备

有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。1515（二）质粒DNA的制备有多种分离质16碱变性法质粒提取的原理：

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会分离。

通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。1616碱变性法质粒提取的原理：16基因工程的载体和工具酶ppt课件17实验材料、器具及药品

实验器具

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器。实验材料含PUCm-T的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

18实验材料、器具及药品实验器具

微量取液器(20μl实验药品1.LB培养基配制及分装(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高压灭菌

19实验药品19培养大肠杆菌一般用LB培养基。为了保证培养的细菌不被污染，一般会在培养基中加入抗性。一般ampr的浓度为50~150ug/ml,tecr的浓度为15~50ug/ml，氯霉素为20ug/ml，kanr为25~50ug/ml。为了从菌体中获得高浓度的质粒，必须控制菌体的生长状态。为此，菌种最好先通过活化、鉴定，然后扩大培养。扩大培养3~4小时候，可以加入？再培养10小时。20培养大肠杆菌一般用LB培养基。为了保证培养的细菌不被污染，一SolutionI: Tris.HCl（pH7.5） 50mM EDTA 10mM

SolutionII:

NaOH 0.2M SDS 1%SolutionIII:Finalconcentration KAc1.32M UsingHActoadjustpHto4.8TE(pH8.0) Tris.HCl（pH8.0） 10mM EDTA（pH8.0） 1mMRNaseA 100µg/ml21SolutionI: Tris.HCl（pH7.5） solutionI重悬细菌solutionII，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开碱裂解法22solutionI重悬细菌碱裂解法22SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。碱裂解法23SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，碱基还质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟或两倍体积的无水（或95％）乙醇混匀，冰上放置10分钟；质粒的纯化：一般采用苯酚(tris饱和酚ph7.0）/氯仿纯化质粒;为满足较高要求，可采用氯化铯密度梯度离心24质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟或两倍体积实验步骤

接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/mlAmp抗生素的LB液体培养基

37℃摇培过夜（10~12h）

12000rpm,3min弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。加100μlⅠ液，涡旋震荡，充分混匀配制适量的Ⅱ液加200μlⅡ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），冰浴，5-10min，此时应有丝状物出现。25实验步骤接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有6加150μlⅢ液，轻轻混匀，冰浴，5min以上此时应有絮状物出现。↓12000rpm,5min取上清液，加等体积的酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色，5min↓12000rpm,10min取上清液，加2倍体积的冷乙醇，混匀，-20℃，30min↓12000rpm,10min弃去上清液，用70%乙醇清洗沉淀↓干燥加20μlTE溶解，4℃保存26加150μlⅢ液，轻轻混匀，冰浴，5min以上2627问题：１）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。2727问题：2728大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量制备物中的杂质。如果依然存在，可用离心柱层析法纯化ＤＮＡ。2828大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量制备物29２）在十分偶然的情况下，个别小量制备物会出现无质粒ＤＮＡ的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。2929２）在十分偶然的情况下，个别小量制备物会出现无质粒ＤＮＡ30（三）质粒载体的改造⑴去掉不必要的DNA区段。⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。⑶加入易于捡出的选择性标记基因。⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。⑸改造或增加基因表达的调控序列。3030（三）质粒载体的改造⑴去掉不必要的DNA区段。30概念酶的星号活性：在非最适条件下，有些核酸限制性内切酶识别序列的特异性便会松动，从其正确识别序列以外的其他位点切割DNA分子，这种现象称星号活性。P131、质粒pBR322p-plasmid的缩写BR-人名缩写，Bolivar和Rodriguez322-是实验室编号31概念酶的星号活性：在非最适条件下，有些核酸限制性内切32

pBR3224363结构：（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr）

3种限制酶单一识别位点。（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点。（3）DNA复制起点（ori）3232pBR322结构：3233pBR322质粒的优点：（1）具有较小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。

pBR32243633333pBR322质粒的优点：pBR3223334怎么筛选到重组子？3434怎么筛选到重组子？343535353536363636372、pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ′基因

编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。（4）MCS区段是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。37372、pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.V38诱导物

ZYX

I

POCAP

ZYX

I

POCAP3838诱导物ZYXI39

乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖

乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。

IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。

LacZ基因编码的乳糖苷酶

X-gal

蓝色吲哚产物

蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷3939乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖40标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H

片段COOH

片段lacZ4040标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段CO41X-galLacZ蓝色化合物X-gal4141X-galLacZ蓝色化合物X-gal41424243（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶4343（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）L互补显色反应

44互补显色反应44请你总结一下哪些方面pUC载体优于pBR载体？45请你总结一下哪些方面pUC载体优于pBR载体？45462、pUC质粒载体与pBR322相比，pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2750bp，pUCl8为2686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过

-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。并且它的多克隆位点与M13载体的多克隆位点相同。46462、pUC质粒载体与pBR322相比，pUC质粒载体优4747T载体

在分子克隆的实践中，人们发现用于PCR的耐热DNA聚合酶（Taq酶）具有一种非模版依赖的活性，这种活性可以在PCR产物的3`端加上一个非配对的脱氧嘌呤嘧啶核苷（A）。根据这一特点研制出了一种质粒，其5`末端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可以将PCR产物以T-A连接的方式进行克隆，即TA克隆。这种载体叫T载体。48T载体

在分子克隆的实践中，人们发现用于PCR的耐热DNAT载体是一个什么样的载体？环形的还是线性的？能够进行自我的复制么？49T载体是一个什么样的载体？环形的还是线性的？能够进行自我的复MCS50MCS50T-vector两条链的3’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个AT-A克隆51T-vector两条链的3’端含有一个游离的TT-A克隆51525253二、噬菌体载体（phagevectors）（一）噬菌体载体（二）M13噬菌体载体（三）柯斯质粒载体5353二、噬菌体载体（一）噬菌体载体5354

噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。5454噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细551.噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期作为分子克隆我们需要使用哪种噬菌体？55551.噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主56

侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖（图1-5）。图左示λ噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。

λ噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。λ噬菌体的生活周期5656侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、57λ噬菌体的生活周期：裂解λ侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。5757λ噬菌体的生活周期：57585858585959595960λ噬菌体的结构和用途λ噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12bp（cos位点，蛋白包装识别信号），对包装的大小有要求：35kb~51kb。感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。6060λ噬菌体的结构和用途λ噬菌体线性双链DNA病毒，具有61λ噬菌体基因大致分为4个区：

结构区A～J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区,重组区

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和N、CI基因，O-R为裂解区.

TailheadrecombinationreplicationlysisCos位点Cos位点6161λ噬菌体基因大致分为4个区：Tailhe62λ噬菌体载体类型置换型（Replacementvectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon4

载体克隆能力大，20～25kb插入型

（Insertionvectors）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：λgt10

、λgt11

克隆能力小，不到10kb

噬菌体载体的类型6262λ噬菌体载体类型置换型（Replacementvecλ噬菌体载体类型①插入型载体:有单一酶切点,便于外源DNA插入(b)λgt10，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，形成清亮的噬菌斑，而cI野生型的为浑浊性噬菌斑，从而很容易识别重组子。

λ噬菌体载体类型①插入型载体:有单一酶切点,便于外源DNA插6364Replacementvectors（如charon4）P20

置换型载体LacZ特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响λ噬菌体裂解生长的能力。只有λDNA的长度大于野生型λ噬菌体DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。而包装外源DNA的上限为25kb。如果用SalI酶切，会有什么结果？6464Replacementvectors（如charon4这一特殊性质作为选择标记：重组子被包装：当EcoRⅠ切开λDNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。非重组子不被包装：如果没有外源DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，由于长度不足，不能包装。未被EcoRI切开的原载体怎样与重组子区分开？65这一特殊性质作为选择标记：重组子被包装：当EcoRⅠ切开λD66它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着β半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。6666它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着野生的λ噬菌体随着DNA的复制，同时合成噬菌体衣壳蛋白和其他包装蛋白，并随时包装成噬菌体颗粒，一般不会在体内积累。缺少了D基因的噬菌体侵染D、E基因与包装蛋白有关的基因侵染缺少了E基因的噬菌体分别有什么现象？会不会裂解？提取两种大肠杆菌的蛋白，其中包含了噬菌体的包装蛋白，然后使之与λDNA混合，既得到完整含有外源基因的λ噬菌体。包装蛋白的制备67野生的λ噬菌体随着DNA的复制，同时合成噬菌体衣壳蛋白和其他sup-细菌头部基因

（琥珀突变型）尾部基因

（琥珀突变型）转录复制

蛋白质合成组装尾部所需要的组分“无头部”的提取物组装头部所需要的组分“无尾部”的提取物温育完整的噬菌体转录复制

蛋白质合成T4噬菌体的体外包装λDNA的体外包装体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的效率高100-10000倍sup-细菌头部基因

（琥珀突变型）尾部基因

（琥珀突变型）6869野生型λ噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，λ的这种表型称为Spi+(对P2的干扰敏感)。当λ基因组中缺少参与重组的red和gam基因时，λ突变体便可以在P2溶原菌中生长，其表型称为Spi-。基因red和gam位于非必需区域内，外源DNA片段能置换基因red和gam形成重组体，其重组体能在recA+的P2溶原菌中繁殖，并且显示出Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶原菌作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。能浸染宿主菌产生噬菌斑的即是重组分子。但这种噬菌斑小且少。λ-DASH重组体的筛选69野生型λ噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，λ69λ噬菌体的构建策略和技术路线用限制性内切酶切去λDNA上的非必须区，提高外源DNA的有效装载量。2.删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性。3.灭火某些与裂解周期有关的基因，使λDNA载体只能在特殊的实验室条件下感染裂解宿主细胞。以避免可能发生的生物污染现象。4.引入合适的筛选标记。如charon4的野生型与重组子的筛选。5.建立重组DNA的体外包装体系。70λ噬菌体的构建策略和技术路线用限制性内切酶切去λDNA上的非71结合

包装过程1．通过裂解过程增殖载体、回收、纯化2．酶切、载体与外源DNA3．连接4．体外包装5．感染/铺平板6．筛选克隆原理及步骤71结合包装过程克隆原理及步骤71

对于一个相对简单的基因家族（如哺乳动物的珠蛋白基因）也要遍布至少70kb的基因组DNA中，而更复杂的可以遍布数十万个碱基对。这种基因的分析通常用染色体“步查”的方法来分析相互重叠的重组子。

由于染色体步查是一个十分缓慢的过程，每一步也许要花费一个月或更长时间，故用黏粒比用噬菌体更有优势。72对于一个相对简单的基因家族（如哺乳动物的珠蛋白基因）73（二）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质粒载体的特点

柯斯质粒是一类人工构建的含有

DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cossitecarryingplasmid的缩写。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成：

A.多克隆位点区

B.含有cos位点的DNA区

C.复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScosDNA7373（二）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质74（二）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质粒载体的特性（cossite-carringplasmid）1、具有噬菌体的特性柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2、具有质粒载体的特性能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3、高容量的克隆能力

cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。7474（二）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯75（二）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质粒载体的应用

噬菌体的位点特异切割体系——末端酶（terminase）体系，识别两个相距38-54kbcos位点，并进行切割，后被包装。

下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源DNA片段串联后重组。OriMarkerMCScosDNA7575（二）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序76采用柯斯质粒作载体的困难①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；77采用柯斯质粒作载体的困难①载体自身只相当于可以插入片段的1/

②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；采用柯斯质粒作载体的困难78②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在797980（二）M13噬菌体

1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性⑵复制与增殖（图）⑴是单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。8080（二）M13噬菌体1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特81M13噬菌体的复制与增殖“＋”DNACPCP脱落，“＋”DNA复制RF－DNA“θ”型复制积累200～300份滚环复制＋SSB外溢时被包装M13噬菌体M13噬菌体首先吸附在F性须上，其吸附的位点看来是在性须的末端。噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部，进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型DNA。它按θ形式进行几轮复制之后，基因Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成M13（＋）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的M13基因组DNA8181M13噬菌体的复制与增殖“＋”DNACPCP脱落，RF－82

M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；③M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。8282M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：82④M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。⑤外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因。83④M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小842.M13噬菌体载体的构建这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。

⑴在IS区内插入LacZ基因⑵在标记基因区内组装MCS区段所以能通过互补在X-Gal/IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了

M13mp8、9和M13mp18、19等。84842.M13噬菌体载体的构建这类载体的突出优点在于其既85质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建基因组文库-++-构建DNA文库+---常规的亚克隆化+---构建新型的DNA结构+---序列分析+--+单链探针+**--+外源基因在大肠杆菌中的表达+---四种常用载体的比较*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低**已有个别材料可用于此目的亚克隆subclone用限制性酶切或PCR等手段从已经克隆的DNA中获得该克隆DNA的部分序列或改造过的序列，再克隆到另外的新载体中的技术。8585质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-在基因克隆中一直困扰着科学家的是载体的容量问题，因为很多基因的序列很长，如人的凝血因子VIII基因长180kb，肌营养不良基因长至少1800kb，这样这些基因很难作为单一片断克隆于这些载体中，如质粒载体等。这样发展起了另外一种技术：酵母人工染色体。86在基因克隆中一直困扰着科学家的是载体的容量问题，因为四、酵母人工染色体载体系统

YAC（YeastArtificialChromosome）

酵母菌的着丝粒-有丝分裂和减数分裂酵母菌的端粒-保证染色体末端完全复制

自主复制顺序-具复制起点的功能

有细菌和酵母的两种选择性标记

1987年DavidBurke构建

2.特点:最大特点是能克隆大DNA片段(平均300Kb,最大2000Kb)

结构组成1.四、酵母人工染色体载体系统

YAC（YeastAr87TRP－色氨酸合成基因

URA3－尿嘧啶合成基因

Sup4-酪氨酸tRNA

TRP－色氨酸合成基因

URA3－尿嘧啶合成基因

Sup488选择标记--Sup4Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成为白色)。不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。89选择标记--Sup4Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNAYAC载体--pYAC4主要结构：①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；③一个自主复制序列(ARS1)；④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点；⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。90YAC载体--pYAC4主要结构：90基因工程的载体和工具酶ppt课件9192第二节基因操作的工具酶一、限制性核酸内切酶及其应用二、DNA连接酶及其应用三、DNA聚合酶及其应用四、修饰性工具酶9292第二节基因操作的工具酶一、限制性核酸内切酶及其应用9393949495（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应一、限制性核酸内切酶及其应用9595（一）限制性核酸内切酶的发现一、限制性核酸内切酶及其96由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现：切酶。9696由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Lin97

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。9797E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶9798限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割9898限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点噬菌体DNA99最早分离出的限制内切酶—1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK，是I型的，没有实用价值。首个II型限制内切酶—1970年，H.O.Smith等从Heamophilusinfluenzae的Rd菌株中HindII。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如NEB（NewEnglandBiolabs）公司的提取和克隆。目前已纯化出400多种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。9999最早分离出的限制内切酶—1968年，Meselson和Y100（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性

特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分

Mg2+位于识别位点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大100100（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性101（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli

表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae

表示为

Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。101101（三）限制性核酸内切酶的命名2、用一个正体字母表示菌株102（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点（93%）1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性

交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。102102（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点（93%）1、识4bp：Sau3AⅠ↓GATC1.长度

4-8bp常见6bp5bp：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG6bp：EcoRⅠG↓AATTC

HindⅢ

A↓AGCTT7bp：BbvCⅠ

CC↓TCAGC

PpuMⅠ

RG↓GWCCY8bp：NotⅠ

GC↓GGCCGC

SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCCW=AorTS=CorG（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点（93%）1034bp：Sau3AⅠ↓GATC1.长度4-8bp回文对称palindrome

切割位点在DNA两条链相对称的位置2.结构两个特点:以某一对核苷酸为中轴,左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补这两股DNA链若按同方向阅读(5’-3’或3’-5’),其核苷酸序列相同104回文对称palindrome2.结构两个特点:以某一对核

EcoRⅠ5’-G↓AATTC-3’

3’-CTTAA↑G-5’

HindⅢ5’-A↓AGCTT-3’3’-TTCGA↑A-5’105

EcoRⅠ5’-G↓AATTC-3’不对称asymmetria

有些酶的识别序列是不对称的

AccBSⅠCCG↓CTC

GGC↑GAG

BssSⅠC↓TCGTGGAGCA↑C106不对称asymmetria

多识别序列（简并序列degeneratesequence）

AccⅠGT↓MKAC

HindⅡGTY↓RACGTAGACGTATACGTCGACGTCTACM=AorCK=GorT

Y=CorTR=AorG

AccⅠHindⅡGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC107

多识别序列（简并序列degeneratesequence间断对称interruptedsymmetriaAlwNⅠCAGNNNC↓TG

GT↑CNNNGAC有些酶的识别序列呈间断对称,对称序列之间含若干个任意碱基DdeⅠC↓TNAG

GANT↑C108间断对称interruptedsymmetriaAlwNⅠ109几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

109109几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProv110与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端Bluntend在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。

同裂酶isoschizomers

能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶isocaudamers

识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamHI、BclI、BglII和XhoI

是一组同尾酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。

110110与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohes111平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P端的平末端例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，识别顺序都是

5’……C|CG

G……3’

3’……G

GC|C……5’

如果其中有5’-甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能够切割，MspI能切割。

111111平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P112

经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII112112经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’XXXXGG(五）II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶的缓冲液：限制性核酸内切酶Mg2+10mMMgCl2

或MgAcBSA100

g/ml，只是少数反应需要DTT（dithiothreitol,二硫苏糖醇）1mM113(五）II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核低0mM中50mM高100mM离子强度NaCl0-150mM

114低中高离子强度NaCl0-150mM114使用浓度不同，酶的活性不同0.5×1×1.5×2×115使用浓度不同，酶的活性不同0.5×1×1.1161163‘CGATGTACCTAG5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHI

SmaIII型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC3‘…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCAAGCGTA…5’限制性核酸内切酶1173‘CGATGTACCTAG5‘…GCTACATGGAT对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥限制性核酸内切酶118对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，影响限制性核酸内切酶活性的因素（1）DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间限制性核酸内切酶119影响限制性核酸内切酶活性的因素（1）DNA样品的纯度（2）DNA样品的甲基化程度：

大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。

大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。

哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。限制性核酸内切酶120（2）DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的da（3）核酸内切酶的缓冲液性质：在“非最适的”反应条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等）,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。

Example：

EcoRI

在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。限制性核酸内切酶121（3）核酸内切酶的缓冲液性质：在“非最适的”反应条件下（高浓影响酶切反应的因素很多，最重要的有：⑴DNA的纯度、浓度（不超过1.5ug/50ul)⑵DNA的甲基化程度（大肠杆菌中含有Dam和Dcm甲基化酶）MboI不能酶切甲基化序列，但同功酶Sau3AI可以⑶酶切反应的温度（通常为37℃

）⑷DNA的分子结构⑸核酸内切限制酶的缓冲液（10X母液）(6）反应时间通常为1.5小时（7）加入酶量不超过总体积的10%

122122123酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMddH2O

约16.5

LBuffer(10X)2.0

LDNA0.2~1.0

gEnzyme1～2UVolume20.0

L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT123123酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37124（一）DNA连接酶的发现（二）DNA连接酶作用特点（三）DNA连接酶的反应条件（四）DNA连接的策略二、DNA连接酶及其应用124124（一）DNA连接酶的发现二、DNA连接酶及其应用12125（一）DNA连接酶的发现环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。

首个DNA连接酶(ligase)——1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码

。1970年，发现了T4DNA连接酶，

由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。E.coliDNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。125125（一）DNA连接酶的发现环形DNA分子的发现使科学家相126（二）DNA连接酶作用的特点A.

连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。126126（二）DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别127

是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。

OHP××是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick.gapNONickOK127127是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化128DNA连接酶连接的作用机制⑴E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppiE(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN⑵E－AMP＋DNA＝DNA－AMP＋E⑶DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。

128128DNA连接酶连接的作用机制⑴128（三）T4DNA连接酶连接反应的条件影响连接效率的因素有：A.温度（通常在4-20℃）B.缓冲体系：tris-HclPH7.5，DTT(二硫苏糖醇），ATPC.酶量（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）D.反应时间（通常连接过夜）E.DNA浓度：插入片段和载体片段的摩尔比（

1∶1～10∶1）

129（三）T4DNA连接酶连接反应的条件影响连接效率的因素有：1130（四）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～1∶10），补足ddH2O至8μl。

3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。（可省略，热脉冲可增加2种分子的碰撞几率）

4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。

130130（四）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一131粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法NickNick131131粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法NickN132平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶132132平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5133平末端DNA片段的连接－衔接物连接法

衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。GGATCCCCTAGG+BamHI切割GATCCG连接酶＋经BamHI切割的pBR322GCCTAGBamHI衔接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG连接酶重组DNA分子GATCCGGCCTAG133133平末端DNA片段的连接－衔接物连接法衔接物(l134（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（二）Klenow片段酶（三）T4DNA聚合酶（四）逆转录酶（反转录酶）三、DNA聚合酶及其应用134134（一）大肠杆菌DNA聚合酶I三、DNA聚合酶及其应用1135

（一）大肠杆菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先从大肠杆菌E。Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性（模板，带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、Mg2+

）双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性3'→5'核酸外切酶活性。从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+＋4dNTPsATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+＋4dNTPsCCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T135135（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（E。Col136

大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接前的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。136136大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.137

大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口转移制备探针PolI+Mg2++［α－32P］

dNTPs137137大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口转移制备探针138138139

（二）

Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD。酶催活性：⑴5’→3’

的聚合酶活性⑵3’→5’

的核酸外切酶活性CCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTAKlenow+Mg2+139139（二）Klenow片段酶Klenow片段是140Klenow片段的主要用途（利用5’→3’

的聚合酶活性）⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端⑵标记DNA片段的末端底物用［α－32P］－dNTPs

⑶DNA序列的测定

140140Klenow片段的主要用途（利用5’→3’的聚合酶补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G