流感病毒神经氨酸酶的研究进展

流感病毒神经氨酸酶的研究进展

流感病毒是人类呼吸道感染的常见原因之一，可导致较高的发病率和死亡率。在流感病毒中,神经氨酸酶(NA)是分布于病毒包膜表面的一种糖蛋白,可催化唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的水解。当流感病毒感染宿主细胞,并利用宿主细胞资源复制完成后,以出芽的形式突出宿主细胞,但是子代病毒与宿主细胞之间仍然依靠血凝素分子末端的唾液酸残基与该分子表面的糖基团以糖苷键链接,这使得流感病毒无法立即脱离宿主细胞。NA负责催化水解这一糖苷键,使新的病毒粒子从宿主细胞释放并阻止病毒聚集,进而感染新的细胞,在患者体内扩散Ⅰ和Ⅱ含有较多的手性中心,价格昂贵且产生了越来越多的抗药性病例最早报道的苯甲酸衍生物类NA抑制剂4-(N-乙酰胺基)-3-胍基苯甲酸(Ⅲ)为了获得更强的抑制活性,经由化合物Ⅴd,继续从活性相对较强的化合物Ⅶ衍生出了不同位置羟基或酮基取代的化合物Ⅹ~Ⅻ,如下所示。1实验部分1.1试剂与仪器4-氨基-3-碘苯甲酸甲酯,萨恩化学技术(上海)有限公司;1-溴-2-乙基-1-丁烯、1-溴-3-正丙基-1-戊烯,日本TCI公司;4-二甲氨基吡啶,上海楷石化工有限公司;间氯过氧苯甲酸,重庆科沃化工有限公司;乙硼烷,百灵威科技有限公司;硅胶(200~300目),乳山市太阳干燥剂有限公司;邻苯二酚硼烷,频哪醇硼烷,上海福兴医药科技有限公司;Pd-C,艾科试剂;四(三苯基磷)钯,科瑞迪化学;四氧化锇,美国Sigma-Aldrich公司;草酰氯,阿拉丁试剂;对甲基苯磺酸,上海邦成化工有限公司;二氯甲烷、硼氢化钠,三乙胺(Et流感病毒菌株H3N2(California/04)、H1N1(California/99)、B(Shanghai/02),美国阿拉巴马伯明翰大学。集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华科技有限公司;SGWX-4型显微熔点仪,上海仪电物理光学仪器有限公司;Hei-VAP旋转蒸发仪,德国Heidolph公司;EX225ZH/AD型分析天平,美国OHAUS公司;6420型质谱仪,美国Agilent科技公司;ARX-400型核磁共振仪,德国Bruker公司;超净工作台,汉闵实验室设备有限公司;FluostarGalary微板光学测定仪及配套荧光测定96孔板,德国BMG公司。1.2目标化合物的合成1.2.1et4-氨基-3-2-乙基-1-丁烯基苯甲酸甲酯b的合成Ⅴb的制备:将1-溴-2-乙基-1-丁烯(6.7mmol)溶于二氧六环(30mL)中,氮气保护在室温下搅拌,然后加入Et4-氨基-3-(2-乙基-1-丁烯基)苯甲酸甲酯(Ⅴb):Ⅴa与Ⅴb的合成过程类似,不同之处为:底物是1-溴-3-正丙基-1-戊烯;硼氢化试剂与1-溴-3-正丙基-1-戊烯的物质的量的比及反应时间基本一致。TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶1,R4-氨基-3-(2-正丙基-1-戊烯基)苯甲酸甲酯(Ⅴa):1.2.2中间体2-2-正丙基-1-戊烯基苯甲酸甲酯2b的合成Ⅴc的制备:将化合物Ⅴa(0.5mmol)溶解在5mL醋酸酐中,在室温下搅拌15min,然后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP,7mg,0.05mmol),将混合物搅拌2h,TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶1,R4-乙酰胺基-3-(2-正丙基-1-戊烯基)苯甲酸甲酯(Ⅴc):Ⅴd与Ⅴc的合成过程类似,不同之处为底物是Ⅴb(0.5mmol);Ⅴb与醋酸酐物质的量的比及反应时间基本一致。TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶1,R4-乙酰胺基-3-(2-乙基-1-丁烯基)苯甲酸甲酯(Ⅴd):1.2.3应完全[展开剂]vv的合成Ⅵ的制备:将Ⅴc(61mg,0.2mmol)溶解在2mL甲醇中,加入2mL1mol/LNaOH。将混合物在室温下搅拌2~3h,TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=2∶1∶0.01,R4-乙酰胺基-3-(2-正丙基-1-戊烯基)苯甲酸(Ⅵ):m.p.110~111℃,与Ⅵ的合成过程类似,不同之处为底物是将Ⅴd(56mg,0.2mmol);Ⅴd与氢氧化钠的物质的量的比及反应时间基本一致,TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=2∶1∶0.01,R4-乙酰胺基-3-(2-乙基-1-丁烯基)苯甲酸(Ⅶ):m.p.110~1111.2.4na4-乙酰胺基-3-2-羟基-2-戊烷基苯甲酸的合成Ⅷ的制备:将Ⅴc(0.33mmol)溶于2mL二氯甲烷中,加入间氯过氧苯甲酸(M-CPBA,96mg,0.43mmol质量分数77%)并在室温下搅拌0.5h后用2mL质量分数10%的Na4-乙酰胺基-3-(2-羟基-2-丙基戊烷基)苯甲酸(Ⅷ)的制备:m.p.166~167℃,Ⅸ与Ⅷ的合成过程类似,不同之处为底物是Ⅴd(0.33mmol);Ⅴd与间氯过氧苯甲酸的物质的量的比及反应时间基本一致,TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=200∶100∶3,R4-乙酰胺基-3-(2-羟基-2-乙基丁烷基)苯甲酸(Ⅸ)的制备:m.p.159~160℃,1.2.5-乙基-1,2-二羟基丁烷基aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3-甲基甲基苯甲酸甲酯aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa将64mg4-甲基吗啉-N-甲氧氮芥,2.5mL水,1mL丙酮,20mgOsO4-乙酰胺基-3-(2-乙基-1,2-二羟基丁烷基)苯甲酸甲酯(Ⅶa):1.2.6tlc-4-2-乙基-1,2-二羟基丁烷基苯甲酸的合成将化合物Ⅶa(93mg,0.3mmol)溶于3mL甲醇中,加入3mL1mol/L的NaOH溶液,然后将混合物在室温下搅拌1h,TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=200∶100∶3,R4-乙酰胺基-3-(2-乙基-1,2-二羟基丁烷基)苯甲酸(Ⅹ)的制备:m.p.218~219℃;1.2.7b合成苯甲酸甲酯向15mL三口圆底烧瓶中加入2mL二氯甲烷和草酰氯(0.2mL,2.2mmol),用磁力搅拌器搅拌,中间放置装有CaSO4-乙酰胺基-3-(2-乙基-2-羟基丁酰基)苯甲酸甲酯(Ⅶb):1.2.8tlc-4-2-乙基-2-羟基丁酰基苯甲酸的合成将化合物Ⅶb(123mg,0.4mmol)溶于4mL甲醇中,加入4mL1mol/L的NaOH溶液,然后将混合物在室温下搅拌2h,TLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=200∶100∶3,R4-乙酰胺基-3-(2-乙基-2-羟基丁酰基)苯甲酸(Ⅺ):m.p.161~162℃;1.2.9nahco4-乙酰胺基-3-2-乙基丁酰基苯甲酸甲酯c的合成将化合物Ⅶb(241mg,0.78mmol)溶解在15mL干燥的甲苯中,加入15mg对甲基苯磺酸(TsOH),110℃回流6h,混合物用25mL甲苯稀释,用饱和NaHCO4-乙酰胺基-3-(2-乙基丁酰基)苯甲酸甲酯(Ⅶc):1.2.1-苯基-2-取代苯甲酸甲酯d和4-甲基-1-羟基丁烷基苯甲酸甲酯d的合成将化合物Ⅶc(88mg,0.3mmol)溶解在干燥的甲醇(0.9mL)和四氢呋喃中(0.9mL),在氩气保护下冷却至0℃,加入NaBH4-乙酰胺基-3-(2-乙基-1-羟基丁烷基)苯甲酸甲酯(Ⅶd):m.p.81~83℃。1.2.1r4-乙酰胺基-3-2-乙基-1-羟基丁烷基苯甲酸的合成将化合物Ⅶd(68mg,0.23mmol)溶于2.3mL甲醇中,加入2.3mL1mol/L的NaOH溶液,然后将混合物在室温下搅拌1hTLC监测反应完全[展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=200∶100∶3,R4-乙酰胺基-3-(2-乙基-1-羟基丁烷基)苯甲酸(Ⅻ):m.p.181~183℃。1.3神经氨酸酶抑制剂用Morphy酶活性实验部分:将30uf06dL含神经氨酸酶的33mmol/L的MES缓冲液(pH=3.5)与10uf06dL4mmol/LCaCl2结果与讨论2.1化合物的合成本研究得到的7个活性化合物中,化合物Ⅵ、Ⅷ分别与Ⅶ、Ⅸ结构类似,在结构上具有一定的代表性。化合物Ⅹ~Ⅻ尽管合成路线较长,但每步反应都是常见反应,操作简单,反应温和可控。由于合成化合物Ⅴa和Ⅴb的反应较复杂,是整个路线的控制性步骤,故以4-氨基-3-碘苯甲酸甲酯和1-溴-2-乙基-1-丁烯合成化合物Ⅴb为例,探讨硼氢化试剂种类和用量对反应收率的影响。2.1.1硼氢化试剂法首先考察硼氢化试剂种类对收率的影响,实验方法同1.2.1,结果见表1。从表1可以看出,当硼氢化试剂分别与反应物1-溴-2-乙基-1-丁烯反应(物质的量比为1∶1)时,乙硼烷和硼酸三甲酯不发生反应。邻苯二酚硼烷多用于还原烯烃,共轭还原α、β-烯醇2.1.2氢化反应条件筛选对硼氢化试剂频哪醇硼烷的用量进行了考察,实验方法同1.2.1,结果如表2所示。由表2可知,频哪醇硼烷为硼氢化试剂时,随着频哪醇硼烷用量的增加Ⅴb的收率先增大后减小,n(硼氢化试剂)∶n(1-溴-2-乙基-1-丁烯基)=3∶1时,最大收率为73.1%,随着硼氢化试剂用量增加至4倍时,反应收率降至67.2%。综合以上结果,应选择n(硼氢化试剂)∶n(1-溴-2-乙基-1-丁烯基)=3∶1的频哪醇硼烷为反应条件。频哪醇硼烷在此反应中主要起活化卤代烃作用和一定的催化作用,这是因为B原子呈弱金属性且含有空电子轨道,容易得到或失去电子,与1-溴-2-乙基-1-丁烯作用可形成频哪醇烯基硼,再与卤代芳烃偶联反应得到Ⅴb。频哪醇硼烷作为硼氢化试剂的反应机理为:频哪醇硼烷进攻卤代烯烃的π电子,形成π配合物后进一步形成弱四元环配合物的过渡态,脱去一分子溴化氢得到频哪醇烯基硼,通过硼氢化反应,与溴相连的碳原子由弱的正电性变为负电性,有利于进攻碘代芳基,使其容易发生偶联反应。频哪醇硼烷作为硼氢化试剂的优点为:(1)反应体系副反应少,反应速度快;(2)反应生成的频哪醇烯基硼较稳定,有利于下一步反应进行;(3)具有更高的官能团容忍度,可用于多种官能团的活化。2.2神经氨酸酶抑制剂采用化学荧光法对各化合物的活性进行测定,表3为7种化合物对A型流感病毒菌株H3N2(California/04),H1N1(California/99)和B型流感病毒菌株B(Shanghai/02)神经氨酸酶的抑制活性。由表3可知,本文的化合物Ⅵ~Ⅻ均显示出抗A型和B型流感病毒神经氨酸酶的活性,对两类A型神经氨酸酶亚型N1,N2都有较强的活性(注:根据酶活性中心结构分类,