研究生分子医学实验技能实验二

生化与分子生物学技术•研究生分子医学实验技能实验二操作流程琼脂糖凝胶板的制备质粒DNA及酶切产物电泳（约1h）（10

μl）酶切操作、保温（1-3h）质粒DNA提取原理与方法、实验操作纯化的质粒DNA（20μl）琼脂糖凝胶电泳结果观察结果分析与问题讨论9月23日9月30日DNA的紫外分光光度法定量测定•研究生分子医学实验技能实验二实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳•研究生分子医学实验技能实验二实验四：DNA的紫外分光光度法定量测定实验三•研究生分子医学实验技能实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳法凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳•研究生分子医学实验技能实验二一、琼脂糖凝胶电泳的功用•研究生分子医学实验技能实验二琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium

bromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。二、实验原理：•研究生分子医学实验技能实验二在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB

）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。三、琼脂糖电泳分离DNA的范围琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。•研究生分子医学实验技能实验二四、电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（

bromophenolblue,Bb

）呈蓝紫色；二甲苯晴（

xylene

cyanol,Xc

）呈蓝色它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。胶浓（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb2

•研究生分子0医.学1实5验k技b能实验二五、影响凝胶电泳的因素•研究生分子医学实验技能实验二在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。3、DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。4、电源电压在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。•研究生分子医学实验技能实验二5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。6、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。•研究生分子医学实验技能实验二六、材料前期实验中提取的质粒DNA和其酶切产物，琼脂糖(Agarose)七、设备水平式电泳装置,电泳仪,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。八、试剂1、5×TBE电泳缓冲液：称取Tris

54g，硼酸27.5g，并加入

0.5M

EDTA

(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液（或30％甘油），贮存于4℃。3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。•研究生分子医学实验技能实验二九、操作步骤1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃，而后到入制胶模具（预先插上样品梳子）中，待胶完全凝固后拨出梳子，取出胶块，放入加有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽内。•研究生分子医学实验技能实验二4、加样：取8μlDNA样品与2μl

6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。•研究生分子医学实验技能实验二5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。电泳方向由负极向正极，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。

6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色5-10分钟。7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。五

注意事项•研究生分子医学实验技能实验二倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使 制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄 坏点样孔点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久•研究生分子医学实验技能实验二•研究生分子医学实验技能实验二•研究生分子医学实验技能实验二•研究生分子医学实验技能实验二•研究生分子医学实验技能实验二1•研究生分子医学实验技能实验二2

3

M

1

2

3

M

1

2

3实验结果酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切结果。点样孔细菌基因组DNAOCL型C型质质粒粒DNDANASC质粒DNA细菌RNA•研究生分子医学实验技能实验二常见问题•研究生分子医学实验技能实验二1、提取的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。2、提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。3、与染色体DNA分离不全；变性过程不完全；试剂配置有问题。紫外分光光度法检测DNA•研究生分子医学实验技能实验二实验四【实验目的】掌握752型紫外分光光度计的使用；学习用紫外分光光度法测定DNA的含量。分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。•研究生分子医学实验技能实验二吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。特点灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛•研究生分子医学实验技能实验二光学光谱区近紫外

可见

近红外

中红外

远红外远紫外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~

780nm•研究生分子医学实验技能实验二780

nm~

2.5

m2.5

m~

50

m50

m~300

m电磁波谱发射光谱红橙黄绿青蓝紫单色光复合光(阳光及钨灯)三棱镜可见光分光光度计光源氢灯紫外分光光度计光源高低研究生分子医学实验技能实验二有关光学原理•研究生分子医学实验技能实验二吸收光谱在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。苯(254nm)•研究生分子医学实验技能实验二甲苯

(262nm)A230

250

270苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱入射光•研究生分子医学实验技能实验二透射光反射光被物质吸收的光光吸收基本定律:Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760)A=lg(I0/It)=k1b比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介质厚研究生分子医度学实(验c技m能)实验二Lambert-Beer定律A或D＝K

C

L吸光度摩尔消光系数吸收物质的光径（cm）溶液浓度（mol/L）•研究生分子医学实验技能实验二紫外光谱分析法原理核酸或核苷酸中的碱基共轭双键对260nm紫外光有特异性吸收，吸收强度与核酸浓度成正比。•研究生分子医学实验技能实验二分光光度计法定量DNA•研究生分子医学实验技能实验二取10

l样品DNA，加入4ml0.1xTE对待测DNA样品做1:400稀释。

0.1xTE作为空白,在波长260nm、280nm、310