浙江工业大学微生物(考研复习资料)

微生物学教案

第一章绪论

计划学时：2学时

重点；微生物学的定义、类群、特点研究对象，微生物学发展的奠基者巴斯德、

科赫对微生物学的贡献。

第一节微生物学的研究对象与任务

一、微生物学的研究对象

微生物一词并非生物分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的

或个体结构较为简单的多细胞的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。因此，

微生物类群十分庞杂，其中包括：不具细胞结构的病毒；单细胞的立克次氏体、

细菌、放线菌；属于真菌的酵母菌与霉菌；单细胞藻类、原生动物等。微生物包

括的种类虽然如此多样，但它们都是较为简单的低等的生命形式，生物学特性比

较接近，加之对它们的研究方法以及在应用方面颇为相似，故常将它们统归于微

生物学的研究范围。但也有人将单细胞藻类与原生动物分别归属于植物学与动物

学中。

地球上的生命大约起源于30多亿年前，在漫长的演化过程中形成了多样性

的物种。按照现行的生物系统发育(Phylogeny)关系(与1987年之前的分类系统

不同；2层下段)，可将这些物种分为3个域，即真细菌(Bacteria)、古细菌

(Archaea)和真核生物(Eucairya)。前两者为原核生物，也统称为细菌(Bacteria),

后者包括从单细胞到高等植物的所有真核生物。真细菌、古细菌的全部和真核生

物的一部分属于微生物的研究范围。

二、微生物学的任务

微生物学是研究微生物及其生命活动规律的学科，研究的内容涉及微生物的

形态结构，分类鉴定，生物生化，生长繁殖，遗传变异，生态分布，以及微生物

对自然界，微生物各类群之间，微生物与其他生物之间的相互作用、相互影响，

微生物在农业、工业、环境保护、医疗卫生事业各方面的应用等。研究微生物及

其生命活动规律，是为了更好地利用、控制、改造微生物，使之为人类服务。

第二节微生物学的发展

一、我国古代对微生物的认识与利用(自学)

二、微生物学的奠基与发展史

1.微生物的发现

在人们真正看到微生物之前，实际上已经猜想或感觉到它们的存在，甚至人

们已经在不知不觉中应用它们。我国劳动人民已很早就认识到微生物的存在和作

用，也是最早应用微生物的少数国家之一。据考古学推测，我国在8000年以前

已经出现了曲麋酿酒了，4000多年前我国酿酒已十分普遍，而且当时的埃及人

也已学会烘制面包和酿制果酒，2500年前我国人民已发明酿酱、醋，知道用曲

治消化道疾病。公元六世纪(北魏时期)，我国贾思勰的巨著“齐民要术〃详细地记

载了制曲、酿酒、制酱和酿醋等工艺。公元九世纪到十世纪我国已发明用鼻苗法

种痘，用细菌浸出法开采铜。到了16世纪，古罗巴医生G.Fracastoro才明确提

出疾病是由肉眼看不见的生物(livingcreatures)引起的。我国明末(1641年)

医生吴又可也提出‘'戾气”学说，认为传染病的病因是一种看不见的“戾气"，其

传播途径以口、鼻为主。

但是真正看见并描述微生物的第一个人是荷兰商人安东•列文虎克(Antony

VanLeeuwenhoek,1632~1723),但他的最大贡献不是在商界而是他利用自制

的显微镜发现了微生物世界(当时被称之为微小动物)，他的显微镜放大倍数为

50〜300倍，构造很简单，仅有一个透镜安装在两片金属薄片的中间，在透镜前

而有•根金属短棒，在棒的尖端搁上需要观察的样品，通过调焦螺旋调节焦距。

利用这种显微镜，列文虎克清楚地看见了细菌和原生动物。首次揭示了一个崭

新的生物世界一微生物界。由于他的划时代贡献，1680年被选为英国皇家学会

会员。

2..微生物学发展的奠基者

继列文虎克发现微生物世界以后的200年间，微生物学的研究基本上停留在

形态描述和分门别类的阶段。直到19世纪中期，以法国的巴斯德(LouisPasteur)

和德国的柯赫(RobertKoch)为代表的科学家才将微生物的研究从形态描述推进

到生理学研究阶段，揭露了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了

分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术，从而奠定了微生物学的基

础，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。巴期德和柯赫是微生物学的奠基

人。

D巴斯德

巴斯德原是化学家，曾在化学上作出过重要的贡献，后来转向微生物学研究

领域，为微生物学的建立和发展作出了卓越的贡献。主要集中在下列三方面。

(1)彻底否定了〃自然发生''学说

"自生说”是一个古老的学说，认为一切生物是自然发生的。到了17世纪，虽

然由于研究植物和动物的生长发育和生活循环，使〃自生说〃逐渐软弱，但是由于

技术问题，如何证实微生物不是自然发生的仍然是一个难题，这不仅是''自生说〃

的一个顽固阵地，同时也是人们正确认识微生物生命活动的一大屏障。巴斯德在

前人工作的基础上，进行了许多试验，其中著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，

空气内确实含有微生物，它们引起有机质的腐败。巴斯德自制了一个具有细长而

弯曲的颈的玻瓶，其中盛有有机物水浸液，经加热灭菌后，瓶内可一直保持无菌

状态，有机物不发生腐败，因为弯曲的瓶颈阻挡了外面空气中微生物直达有机物

浸液内，一旦将瓶颈打断，瓶内浸液中才有了微生物，有机质发生腐败。巴斯德

的实验彻底否定了"自生说”，并从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展。

(2)免疫学一预防接种

Jenner虽然早在1798年发明了种痘法可预防天花，但却不了解这个免疫过

程的基本机制，因此，这个发现没能获得继续发展。1877年，巴斯德研究了鸡

霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病。其后他又研究了牛、

羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病

作出了重大贡献。

(3)证实发酵是由微生物引起的

酒精发酵是一个由微生物引起的生物过程还是一个纯粹的化学反应过程，曾

是化学家和微生物学家激烈争论的问题。巴斯德在否定“自生说”的基础上，认为

一切发酵作用都可能和微生物的生长繁殖有关。经不断地努力，巴斯德终于分离

到了许多引起发酵的微生物，并证实酒精发酵是由酵母菌引起的。此外，巴斯德

还发现乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是不同细菌所引起的。为进一步研究微

生物的生理生化奠定了基础。

(4)其他贡献

一直沿用至今天的巴斯德消毒法(60〜65C)作短时间加热处理，杀死有害

微生物的一种消毒法)和家蚕软化病问题的解决也是巴斯德的重要贡献，他不仅

在实践上解决了当时法国酒变质和家蚕软化病的实际问题，而且也推动了微生物

病原学说发展，并深刻影响医学的发展。

2).柯赫

柯赫(图1-5)是著名的细菌学家，由于他曾经是一名医生，因此对病原细菌

的研究作出了突出的贡

(1)具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。

(2)发现了肺结核病的病原菌，这是当时死亡率极高的传染性疾病，因此柯赫

获得了诺贝尔奖。

(3)提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则一柯赫原则。由

于柯赫在病原菌研究方面的开创性工作，自19世纪70年代至20世纪20年代成

了发现病原菌的黄金时代，所发现的各种病原微生物不下百余种，其中还包括植

物病原细菌。

柯赫除了在病原菌研究方面的伟大成就外，在微生物基本操作技术方面的贡

献更是为微生物学的发展奠定了技术基础，这些技术包括：

(1)用固体培养基分离纯化微生物的技术，这是进行微生物学研究的基本前

体，这项技术一直沿用至今。

(2)配制培养基。也是当今微生物学研究的基本技术之」这二项技术不仅是

具有微生物学研究特色的重要技术，而且也为当今动植物细胞的培养作出了十分

重要的贡献。

巴斯德和柯赫的杰出工作，使微生物学作为一门独立的学科开始形成，并出

现以他们为代表而建立的各分枝学科，例如细菌学、消毒外科技术，免疫学、土

壤微生物学、病毒学、植物病理学和真菌学、酿造学以及化学治疗法等。微生物

学的研究内容日趋丰富，使微生物学发展更加迅速。

小结

1.微生物是由荷兰商人列文虎克首先发现的，至今有300多年的历史。微生

物的主要特征是：个体小、结构简单、繁殖快、易培养、易变异、分布广。它一

方面具有其它生物不具备的生物学特性，另一方面它也具有其它生物共有的基本

生命特征。

2.微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结构、生理生化、遗传变异以

及微生物的进化、分类、生态等生命活动规律及其应用的•门学科。诞生于19

世纪中期，其奠基人是法国的巴斯德和德国的柯赫。20世纪获得全面发展，形

成了许多分支学科。特别是40年代以后微生物学促进了整个生命科学的发展，

跃居中心地位。

3.我国是最早知道利用微生物的少数国家之一。但作为一门学科发展起始于

20世纪初，曾在某些病原菌的研究和防治以及微生物在工、农业上的应用和研

究等方面，作出具国际先进水平的工作。近年来，在微生物基因组的研究工作方

面与国际发展前沿接轨，在微生物应用方面已取得可喜成绩。

4.21世纪的微生物学将更加绚丽多彩。多学科的交叉、基因组研究的深入和

扩展将使微生物学的基础研究及其应用出现前所未有的局面。

思考题

1.用具体事例说明人类与微生物的关系。

2.为什么微生物学比动、植物学起步晚，但却发展迅速?并成为生命科学研究

的"明星”？

3.简述微生物学在生命科学发展中的地位，并描绘其前景。

4.为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人？

第二章微生物的纯培养和显微技术

计划学时：2

重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。

第一节微生物的分离和纯培养

一、无菌技术

微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研

究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的

微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物

的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为

无菌技术(aseptictechnique),它是保证微生物学研究正常进行的关键。

1.微生物培养的常用器具及其灭菌

试管、玻璃烧瓶、平皿(culturedish,Petridish)等是最为常用的培

养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物

的营养物质称为培养基可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌

的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最

耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有

些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，

试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、

塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿

是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染

2.接种操作

用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转

接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开

器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操

作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作(图2T),

或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作(图2-2)。操作箱或操作室内的

空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维

持无菌状态。

用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，般采用易于迅速加热和冷

却的银格合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无

菌吸管或移液枪。

二、用固体培养基分离纯培养

单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形

成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落(colony)o当固

体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔(lawn)0不同微生物在特定培

养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行

分类、鉴定的重要依据(图2-3)。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细

胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯

培养。所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指固体培养基倒

入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离

和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养

基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用

的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的

采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的

最常用手段。

1.稀释倒平板法(pourplatemethod)

先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1,000、

1:10,000.....),然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50C左右

的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能

含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面

或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁

殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

2.涂布平板法(spreadplatemethod)

由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的

死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧

气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。

其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一

定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分

散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4）。

3.平板划线法（streakplatemethod）

用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划

线、扇形划线或其他形式的连续划线（图2-5）,微生物细胞数量将随着划线次

数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经

培养后，可在平板表面得到单菌落。

4.稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod）

用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中

不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容

器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌

氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的

一种变通形式*。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并

保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均

匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养

基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌落的挑

取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡一石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼

脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀

将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

三、用液体培养基分离纯培养

对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种

类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养

基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要

用液体培养基分离来获得纯培养。

通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺

序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀

释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可

能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培

养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释

度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

四、单细胞（他子）分离

稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种

类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离

法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细

胞（或单抱子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大

的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。

对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中

转移清洗儿次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微

镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。

目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装

置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生

物细胞或抱子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在

显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下

观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技

术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。

五、选择培养分离

没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在

一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有

能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设

计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生

物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可

能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分

离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中，

除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的，因此,

要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数

量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到

该种微生物的。例如，若某处的土壤中的微生物数量在10-时，必须稀释到10-6

才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为10门,显然不

可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据

该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或

抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过•定时间培

养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。

1.利用选择平板进行直接分离

主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如

在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平

板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白

质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少

工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条

件进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；

有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利

用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生

物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物

接种，反复进行，得到纯培养物。

2.富集培养

主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使

仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能

够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微

生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外

线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。图2-7描述了采用富集方法从土壤

中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。首先配制以对羟基

苯甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种

于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大

量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次

重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂

布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是

能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基

苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生

长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的

确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生

物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。

富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的儿乎无

穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供

了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生

物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中

能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。

六、二元培养物

分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很

难作到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物

称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中

只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元

培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格

的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生

物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能

达到的最接近于纯培养的培养方法。

在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室

培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和

粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养,

但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。

七、微生物的保藏技术

通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定

时间内不死亡，不会被其它微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性

状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏

是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意

义，许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会

（CCCCM）,中国典型培养物保藏中心（CCTCC）,美国典型菌种保藏中心，美国

的“北部地区研究实验室”，荷兰的霉菌中心保藏所，英国的国家典型菌种保藏

中心以及日本的大阪发酵研究所（IFO）等。国际微生物学联合会（IAMS）还专

门设立了世界菌种保藏联合会（WFGC）,用计算机储存世界上各保藏机构提供的

菌种数据资料，可以通过国际互联网查询和索取，进行微生物菌种的交流、研究

和使用。

生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不

例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条

件，使其存活而得以延续。例如利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续移种，

或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令菌株

的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间

内得到保存，有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条

件使保藏物恢复活力。

1.传代培养保藏

传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常

用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针

对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种，以免由于

菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保藏微

生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。-一般

来说，通过降低培养物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。

例如在菌株生长良好后，改用橡皮塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡，并放置

低温保存；将一些菌的菌苔直接刮入蒸储水或其它缓冲液后，密封置4℃保存，

也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液保藏

法。

由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变

而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在

一般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的菌种进行保存外，还必须根据

条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。

2.冷冻保藏

将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生

物都能通过冷冻进行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者

则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞,

尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶小而

减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温

也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5

mol/L左右的廿油或二甲亚枫可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护

细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯毗咯烷酮（PVP）虽不

能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采

用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。

-一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮

保藏可达到一196℃。因此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等

方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方法中是较理想的一种。但液氮

保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱保藏

使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在一70℃低温冰箱中保

存菌株或细胞的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感

受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可利用一20~30℃的普通冰箱保存菌

种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内，常会由于

冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强

烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意

经常检查保藏物的存活情况，随时转种。

3.干燥保藏法

水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干

燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。

沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术o前者主要

适用于产抱子的微生物，如芽抱杆菌、放线菌等。一般将菌种接种斜面，培养至

长出大量的狗子后，洗下弦子制备袍子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥,

直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，

并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂

采用。

冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空

下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境

中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠,

可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损

伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安甑管

的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是

最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要的微

生物保存手段。

除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保

藏、寄主保藏等。由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有

不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此,

在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件

等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不

同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

第二节显微镜和显微技术

绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助

显微镜放大系统的作用才能看到到它们的个体形态和内部构造。除了放大外，决

定显微观察效果的还有二个重要的因素，即分辨率和反差。分辨率是指能辨别两

点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的自

身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作

和观察技术，这就是显微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、

结构，而且发展到对物体的组成成分定性和定量，特别是与计算科学技术的结合

出现的图象分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的奥秘增添了强大武器。

一、显微镜的种类及原理

1.普通光学显微镜

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称

为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、

支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系

统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、目

镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。i般的显微镜

都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如

明视野、暗视野、相差等。

对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度

看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：

分辨率（•小可分辨距离）=&鸟

nsinu

式中九为所用光源波长；。为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作

距离（图2-8）；n为玻片与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性

而选用不同的介质，例如空气（n=LO）、水（n=L33）、香柏油（n=1.52）等。nsin0

也被表示为数值孔径值（NumericalAperture,NA）,它是决定物镜性能的最重要

指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（X=450nm）作为光源时在油镜下可

以达到其最大分辨率，0.18（表2-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般为0.25

mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到1,000〜1,500倍，在

此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。

2.暗视野显微镜

明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视

野显微镜下观察是透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现

斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物

镜（图2-9）,因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不

到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背

景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透

明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通

过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性。

3.相差显微镜

光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显

的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形

态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光

线通过这种标本时,直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少,

加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不

到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的干涉

现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透

明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同

部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比

较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细

胞及细胞内的某些细微结构，是显微技术的一大突破，为此，其发明人F.Zernike

获得了1953年的诺贝尔奖。

4.荧光显微镜

有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光,

这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下

表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波

长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微

镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境

微生物学、分子生物学中应用十分普遍。

5.透射电子显微镜

6.扫描电子显微镜

7.扫描隧道显微镜

二，显微观察样品的制备

样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一

般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点

采用合适的制样方法外，还应考虑生物样品的特点，尽可能地使被观察样品的生

理结构保持稳定，并通过各种手段提高其反差。

1.光学显微镜的制样

光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体直接观察和染色观察二种

基本使用方法。

（1）活体观察

可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗视野或相差显微镜下

对微生物活体进行直接观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微

生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性、及生长

过程中的形态变化如细胞分裂、芽抱萌发等动态过程。

①压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察；

②悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进

行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林；

③菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌狗子悬

液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。

(2)染色观察

一般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率

与其背景相差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态和

运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们

进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。

染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：一是杀死细菌

并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化

学固定二种方法。固定时应注意尽量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。

而染色则根据方法和染料等的不同可分为很多种类。

小结

1从混合在一起的微生物群体中得到特定的某•种微生物的纯培养，是研究

和利用微生物的最重要的环节之一。无菌操作技术是微生物学的重要技术，而且

广泛地被其它学科和生产实际所利用。

2通过稀释或划线等手段，在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯

种分离手段。

3传代培养、干燥保藏、冷冻保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。

4微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显

微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的二个最重要的因素。它们与显微

镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。无论是光学显微镜还是电子显

微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。

5在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物

的重要依据之一。

思考题

1.一般说来，严格的无菌操作是一切微生物工作的基本要求，但在分离

与培养极端嗜盐菌时常在没有点酒精灯的普通实验台上倾倒培养平板、在

日常环境中直接打开皿盖观察和挑取菌落，而其研究结果并没有因此受到

影响，你知道这是为什么吗？

2.如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验？

3.为什么光学显微镜的目镜通常都是15X?是否可以采用更大放大倍

率的目镜(如30X)来进一步提高显微镜的总放大倍数？

4.培养条件对微生物个体的大小有那些影响？你是否能很快地在显微镜

下区分同为单细胞的细菌、酵母菌、和原生动物？

第三章微生物类群与形态结构

计划学时：6学时

重点：细菌、酵母菌、放线菌、霉菌的形态结构与功能

微生物类群庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形

态的微生物称为细胞型微生物。按其细胞结构又可分为原核微生物和真核微生

物。原核微生物包括细菌、放线菌、蓝细菌及其相近的微生物如立克次氏体、支

原体、衣原体、螺旋体、粘细菌、鞘细菌和蛭弧菌，它们是本章介绍的重点。真

核微生物只简单介绍真菌界中的霉菌和酵母菌，而非细胞型生物病毒和类病毒，

将在第三章中系统介绍。

由于新设备、新技术、新概念的应用和发展，对于原核微生物和真核微生物细胞

的细微结构及功能有了比较深入的认识。了解二者之间的主要区别(表2T),对

于学习现代生物学理论、学好微生物这无疑大有帮助。

从表2T可知，原核微生物主要的共同特点是：细胞内有明显核区，但没有

核膜包围；核区内含有一条双链DNA构成的细菌染色体；能量代谢和很多合成代

谢均在质膜上进行；蛋白质合成〃车间”一核糖体分布在细胞质中。

第一节细菌

细菌(bacteria)是微生物的一大类群，在自然界分布广、种类多，与人类

生产和生活的关系也十分密切，是微生物学的主要研究对象。由于细菌的细胞结

构在原核生物中具有代表性，而且近年来研究得较为深入，故作为本章重点。

一、细菌的形态和排列

尽管细菌种类繁多，就单个有机体而言，其基本形态可分为球状、杆状与螺旋状

三种：分别被称为球菌、杆菌和螺旋菌。

(-)球菌细胞呈球形或椭圆形。它们中的许多种，在分裂后产生的新细

胞常保持一定的空间排列方式，在分类鉴定上有重要意义。

1、单球菌细胞单个，分散。

2、双球菌细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列。如肺炎双球菌。

3、链球菌细胞沿一个平面分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状。

如溶血链球菌、乳链球菌。链的长短往往具特征性，例如乳链菌每2-3个细胞形

成•串，而无乳链球菌则形成很长的链。

4、四联球菌细胞分裂沿两个互相垂直的平面进行，分裂后四个细胞特征性地

连在一起，呈田字形。如四联微球菌。

5、八叠球菌细胞沿着三个互相垂直的方面进行分裂，分裂后每八个细胞特征

性地叠在一起呈一立方体。。

6、葡萄球菌细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群集，犹如一串

葡萄。如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌。

上述排列是细菌种的特征。但是，一定种的全部细胞，不一定都按照一种方式排

列，占优势的排列方式才是重要的。

（二）杆菌细胞呈杆状或圆柱形。各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有

的粗短，有的细长。短杆菌近似球状，长的杆菌近丝状（图2-3）。一般来说，同

一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变

化。有的杆菌很直，有的稍弯曲。有的两端截平，如炭疽芽抱杆菌,，有的略尖，

如鼠疫巴斯德氏菌，有的半圆。

杆菌细胞常沿一个平面分裂，大多数菌体分散存在，但有的杆菌呈长短不

同的链状，有的一个紧挨一个呈栅栏状或八字形。以上排列方式，在一些情况下

并非形态学特征，而是生长阶段或培养条件等原因造成。因此，对大多数杆菌来

说，其细胞排列方式在分类鉴定中作用不大。

杆状菌是细菌中种类最多。工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。杆菌中也有不

少是致病菌。

（三）螺旋菌细胞呈弯曲杆状的细菌统称螺旋菌。螺旋形细菌细胞壁坚韧，

菌体较硬，常以单位细胞分散存在。不同种的细胞个体，在长度、螺旋数目和螺

距等方面有显著区别，据此可再分为弧菌与螺旋菌两种状态。

弧菌菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，犹如"C〃字，或似逗号，如霍

乱弧菌，又名逗号弧菌。这类菌往往与一些略弯曲的杆菌很难区分。

螺旋菌菌体回转如螺旋状。螺旋数目和螺距大小因种而异。有的菌体较短，

螺旋紧密；有些很长，并呈现较多的螺旋和弯曲，例如减少螺菌等。在观察形态

时，应特别注意螺旋的和波浪的细胞形态、旋转或波纹的数目以及细胞长度。

弧菌与螺旋菌的显著特征，前者往往为偏端单生鞭毛或丛生鞭毛，后者两端

都有鞭毛。

值得注意的是，螺旋菌与螺旋体目的生物在形态上很相似，螺旋体也是一类

原核微生物，但不是细菌。有关螺旋体的知识，将在第四节中叙述。

球菌、杆菌和螺旋菌是细菌的三种基本形态。此外，还有些具有其他形态的

细菌，如柄杆菌属，细胞呈杆状或梭形，并具有一根特征性的细柄，可附着于基

质上。又如球衣菌属，能形成衣鞘，杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状。

细菌的形态明显地受环境条件的影响，如培养温度、培养时■间、培养基的

组成与浓度等发生改变，均可能引起细菌形态的改变。一般处于幼龄阶段和生长

条件适宜时，细菌形态正常、整齐，表现出特定的形态。在较老的培养物中，或

不正常的条件下，细胞常出现不正常形态，尤其是杆菌，有的细胞膨大，有的出

现梨形，有的产生分枝，有时菌体显著伸长以至呈丝状等，这些不规则的形态统

称为异常形态。若将它们转移到新鲜培养基中或适宜的培养条件下又可恢复原来

的形态。

依其生理机能的不同，可将异常形态区分为畸形和衰颓形两种。

畸形由于化学或物理因子的刺激，阻碍了细胞的发育而引起的形态异常。例如

巴氏醋杆菌通常为短杆状，由于培养温度改变。使之变为纺锤状、丝状或链锁状

（图2-6）o

衰颓形由于培养时间过长，细胞衰老，营养缺乏，或因自身代谢产物积累

过多等原因而造成的形态异常。这种细胞，繁殖能力丧失，形体膨大，形成液泡，

着色力弱，有时菌体尚存，实已死亡了。例如乳酷芽抱杆菌，正常形态长杆状，

衰老时则成为分枝状的衰颓形。

上述原因导致的形态异常往往是暂时的，在一定条件下又可恢复正常。因

此，在观察比较细菌形态时，必须注意因培养条件的变化而引起的形态变化。

二、细菌的大小

细菌大小随种类不同差别很大。有的与最大的病毒粒子大不相近，在光学显微镜

下勉强可见，有的与藻类细胞差不多，几乎肉眼就可辨认，但多数细菌居于二者

之间。

尽管细菌细胞微小，采用显微镜测算。球菌大小以其直径表示，杆菌和螺旋菌以

其长度与宽度表示。不过螺旋菌的长度是菌体两端点间的距离，而不是真正的长

度，它的真正长度应按其螺旋的直径和圈数来计算。

微米:micrometer,缩写口m,1微米=10-3毫米（mm）］是测量细菌大小的常

用单位。最小的细菌只0.2微米，最大的可长达80微米，但-一般不超过儿微米。

球菌直径多为0.5T微米；杆菌直径与球菌相似，长度约为直径的一倍或几倍。

杆菌还可细分为小型杆菌（0.2-0.4X0,7T.5微米）、中型杆菌（0.5-1X2-3微米）

和大型杆菌（1T.25X3-8微米）；螺旋菌为0.3-1X1-50微米。细菌大小的比较

见表2-2o

三、细菌细胞的结构

研究和认识细菌细胞的结构，是分子生物学的重要内容之一。细菌是最小的

细胞生物，20世纪50年代以前，对其结构与组成知道甚少。由于电子显微镜的

使用和生化技术的进展，已逐渐认识到原核细胞与真核细胞间的重大区别。典型

的原核细胞一细菌，其结构可分为两部分：一是不变部分或基本结构，如细胞壁、

细胞膜、细胞核和核糖体，为全部细菌细胞所共有；二是可变部分或特殊结构，

如鞭毛、散毛、荚膜、芽抱和气泡等。这些结构只在部分细菌发现，可能具某些

特定功能。在适宜条件下，所有这些结构都可以通过电子显微镜像观察，并能对

它们在细胞中的排列、分布加以分析研究。

单纯观察结构是不够的，关键是要了解细胞每个结构的化学组成。细胞的组

成也可分为两类，一类是不变的，为所有细菌或原核生物所共有，是生命活动所

绝对需要的；另一类是可变的，在部分细胞中发现，可能具备某种特殊功能。

为了检查这些化学组成，常常把某一结构进行分离提纯和分析。现已很详尽

地了解了许多不同细菌细胞的结构组成，这对于进一步了解细胞机能是很重要

的。

（一）细胞壁

细胞壁是位于细胞表面，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧、略具弹性的结

构。占细胞于重的10-25%o

细胞壁具有保护细胞免受机械性或渗透压的破坏，维持细胞外形的功能。失

去细胞壁后，各种开头的细菌都将变成球形。细菌在一定范围的高渗溶液中原生

质收缩，出现质壁分离现象，在低渗溶液中，细胞膨大，但均不会改变形状或破

裂，这些都与细胞壁具有一定坚韧性和弹性有关，细胞壁的化学组成，使之具有

一定的抗原性、致病性以及对噬菌体的敏感性，细胞壁可能为鞭毛运动提供可靠

的支点，具有鞭毛的细菌失去细胞壁后，仍保持其鞭毛，但不能运动，可见细胞

壁的存在是鞭毛运动所必需的。细胞壁实际上是多孔性的，具一定屏障作用，水

和某些化学物质可以通过，但对大分子物质有阻拦作用。

细胞壁在电子显微镜下清晰可见，并可测知厚度。用机械方法使细菌破裂后，细

胞内含物逸去，借差异离心术，可以分离得到纯的细胞壁（图2-9）。采用质壁分

离与染色方法，可在光学显微镜下看到细胞壁（图2-10）。如果用阿拉（Hale）法

阿拉（Hale）法即先用1%的磷铝酸，然后用设的甲基绿溶液染色染色，细胞质不

着色，细胞壁却呈绿色。

不同的细菌，细胞壁的化学组成和结构不同。通过革兰氏染色法可将所有

细菌的重要方法，1884年由丹麦人革兰氏发明。其染色要点：先用结晶紫染液

染色，再加媒染剂一碘液处理，使菌体着色，然后用乙醇脱色，最后用复染液（沙

黄或番红）复染。显微镜下菌体呈红色者为革兰氏染色阴性细菌（常以G表示），

呈深紫色者为革兰氏染色阳性反应细菌（常以G-表示）。G"菌与G菌细胞壁的化学

组成结构具有明显差异。

1、革兰氏阳性细菌（Gram-positivebacteria）

细胞壁的化学组成以肽聚糖（peptidoglycam）为主，这是原核生物所特有的

成分，占细胞壁物质总量的40-90%o另外还结合有其他多糖及一类特殊的多聚

物--磷壁（酸）质（teichoicacid）。肽聚糖是一■个大分子复合体，由若干个N-乙

酰葡萄胺（简写NAG）和N-乙酰胞壁酸（，简写NAM）以及少数氨基酸短肽链组成的

亚单位聚合而成。NAG和NAM相间排列，以B1,4葡萄糖昔键连接，形成肽聚糖

多糖链，其长度因菌种而异，一般每条多糖链有10-56个二糖单位（或氨基糖），

例如金黄色葡萄球菌最短，只有9个二糖单位，而地衣芽抱杆菌可多达79个单

位。以肽键连接的氨基短肽，形成了肽聚糖的肽链，其氨基酸的组成和排列顺序,

通常为L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-二氨基酸（即L-赖氨酸或二氨基庚二酸等）和D-

丙氨酸。这些短肽，通过D-乳酰竣基连在部分或全部N-乙酰胞壁酸的残基上。

相邻的短肽通过一定的方式将肽聚糖亚单位交叉联结成重复结构。革兰氏阳性细

菌肽聚糖分子中的75%的亚单位纵横交错连接，从而形成了紧密编织、质地坚硬

和机械性强度很大的多层的三度空间风格结构。如枯草芽抱杆菌的肽聚糖分子可

达20层之多。许多G,菌肽聚糖亚单位的组成及连接方式见图2-11和图。

磷壁（酸）质又名垣酸，是大多数革兰氏阳性细胞壁组成基质所特有的化学成

分。它以末端的磷酸二酯键连接于N-乙酰胞壁酸第六位碳原子上，可能占细胞

壁干重50%,它是多元醇和磷酸的聚合物，能溶于水。其主链一般由数十个磷酸

核糖醇或磷酸甘油组成，有的还具有由氨基酸或还原糖构成的侧链。根据主链组

成的不同，分别称为甘油型和核糖醇型两种。

核糖醇磷壁（酸）质是以磷酸二酯键把两个相邻的核糖醇第一位和第五位的

碳原子连接起来。大多数核糖醇残基在第二位碳原子上接一个D-丙氨酸，而第

三和第四位碳原子上可由不同的糖（葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺）取代。核

糖醇磷壁（酸）质的链较长,少者为10个残基,多者有40-50个残基。甘油磷壁（酸）

质在相邻的两个磷酸甘油第一位与第三位碳原子上的羟基则与D-丙氨酸或糖连

接。少量的甘油磷壁（酸）质也分布在细胞膜中，被称为膜磷壁（酸）质或脂磷壁（酸）

质，它们同膜中的糖脂共价结合。除个别球菌外，革兰氏阳性细菌的细胞壁都只

含••种磷壁（酸）质。磷壁（酸）质的存在，使细胞壁形成了一个负电荷环境，大大

加强了细胞膜对二价离子的吸附，尤其是Mg2+。而高浓度Mg2+的存在，对于保

持膜的硬度，提高细胞壁合成酶的活性极为重要；另有报道认为，磷壁（酸）质在

细胞表面构成了有利于噬菌体吸附的受体位点，也是细胞壁深层的一种抗原物

质。

2、革兰氏阴性细菌（Gram-negtivebacteria）

革兰氏阴性细菌细胞壁的组成和结构比革兰氏阳性细菌更复杂。其结构层次

明显，分为内壁层和外壁层。

内壁层紧贴细胞膜，厚约2-3nm,是一单分子层或双分子层，占细胞壁干重

5-10%,由肽聚糖组成。肽聚糖多糖链结构与革兰氏阳性细菌相同，但肽链中的

L-赖氨酸往往被其他二氨基酸取代。由于它们只有30%的肽聚糖亚单位彼此交织

联结，故其网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固，显得比较疏松（图2-16和图

2-17）o外壁层覆盖于肽聚糖层的外部、表面不规则，切面呈波浪形。外壁层可

再分为内、中、外三层。最外层为脂多糖层，中间为磷脂层，内层为脂蛋白层，

它以脂类部分与肽聚糖肽链中的二氨基庚二酸连接。某些细菌的抗原性、致病性

以及对噬菌体的敏感性均与这些成分有关。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞外壁层

的主要成分，也是革兰氏阴性细菌细胞壁中独有的成分，其化学组成因种而有一

定差别。分子结构非常复杂，分子量在一万以上。它由三个部分组成，即核心。

0-侧链和脂质。核心部分由5-10种糖类。乙醇胺和磷酸盐组成核心链，其中2-

酮-3-脱氧辛酸和庚糖是少见的成分，多个核心链通过磷酸酯键彼此连接。核心

的一体抗原。不同种或型的细菌，0-侧链的组成和结构（如多糖的种类和序列）

均有变化，构成了各自的特异性抗原，像沙门氏菌，根据0-抗原可再细分为1,

000多个血清型，这些血清型的沙门氏菌，核心部门相同，而0-抗原的差异，使

之在免疫学和临床诊断中具有重要意义。非致病性革兰氏阴性细菌细胞壁组成中

不具0-侧链，只有核心。核心的另一端以共价键连接脂质，由葡萄糖、半乳糖、

N-乙酰葡萄糖胺、脂肪酸和磷酸组成，是脂多糖的主要毒性成分。

综上所述，除支原体外，几乎所有的原核生物都具有坚韧的细胞壁，通过

革兰氏染色法，可将它们分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两大类，二者的

细胞壁差别很大。革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，只有一层，主要由肽聚糖组成，

革兰氏阴性细菌却有内壁层和外壁层两（图2-20）,它们的成分也不同，从化学

组成看，革兰氏阳性细菌却有内壁层和外壁层两层（40-90%）,含脂量低，而革兰

氏阴性细菌正好相反（表2-3）。此外，二者肽聚糖亚单位联结的方式也有些差异。

肽聚糖亚单位间的交联，通常由一条肽链的第四个基的竣基同另一条和第三个氨

基酸的自由氨基，以氨基酸间桥连接，并通过以下几种方式构成肽聚糖同网格：

1.直接以肽链交联，如大肠杆菌（图2-21,A）；2.加进单一的氨基酸，多种革兰

氏阴性细菌属此方式（图2-21,B）；4.通过一条与连接在胞壁酸上的四肽链基本

相同的额外多肽链交联，如溶壁微球菌。细菌细胞组成中，胞壁酸、磷壁（酸）

质、二氧基庚二酸、D-氨基酸等是细菌以及与之相近的原核生物细胞壁中所特有

的。D-氨基酸的存在，有助于抵抗普通蛋白酶和肽酶的分解作用。

3.细菌细胞壁与革兰氏染色反应

关于革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌细胞壁结构和组成的区别对革兰氏

染色反应有何关系，尚待研究。现在大多认为，在染色过程中，细胞内形成了深

紫色晶紫-碘复合物。这种复合物可被酒精从革兰氏阴性细菌细胞内浸出，而阳

性菌则较困难。这是由于阳性细菌细胞壁较厚，尤其是肽聚糖含量较高，网格结

构紧密，含脂量又低，当它被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔

么缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫-碘复合物的逸出，故菌体呈深紫色;

可是，革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖层较薄，含量较少，而脂抽提出来，故革

兰氏阴性细菌菌体呈复染液的红色。此外还有其他的解释。但很多观点都涉及到

细胞壁的结构与组成，结晶紫-碘复合物与细胞壁、细胞膜的关系。研究者发现,

细胞内的核酸和核蛋白、脂类、磷酸盐复体如多元醇磷酸盐、或多糖和核酸，这

些物质都能保留结晶紫-碘复合物在细胞内不至脱色。

4.细胞壁缺陷细菌

用溶菌酶处理细胞或在培养基中加入霉素等因子，使可破坏或抑制细胞壁的

形成，成为细胞壁缺陷细菌。通常包括原生质体、球形体和细菌L-型。用溶菌

酶除去革兰氏阴性菌细胞壁时，若先用乙二胺四乙酸（EDTA）处理一下外壁，则效

果要好些。

原生质体（protoplast）在革兰氏阳性细菌培养物中加溶菌酶或在含青霉素等的

培养基里培养阳性细菌，便可破坏或抑制细胞壁的合成。细菌除去细胞壁后剩下

的部分叫做原生质体。原生质体由于没有坚韧的细胞壁，故任何形态的菌体均呈

球形。对环境条件很敏感，而且特别脆弱，渗透压、振荡、离心以至通气等因素

都易引起原生质体破裂，有的原生质体还保留着鞭毛，但不能运动，也不能被相

应的噬菌体感染。可是其他生活性基本不变，在适