超高效液相色谱-质谱联用法测定火炬松和湿地松

超高效液相色谱-质谱联用法测定火炬松和湿地松

松花粉又名松花和松黄，通常指松茸。1材料和方法1.1研究材料和方法分别以种植于广东省台山市红岭种子园的湿地松和湿加松，信宜市林业科学研究所的马尾松和英德市林业科学研究所的火炬松为研究材料。分别随机收集了4个树种18个单株的花粉。每3个单株的花粉混合为一份样品，共6个生物学重复。1.2超声条件下ml甲醇溶液制备各样品分别精确称取200mg(±1%)于10u202fmLEP管中。随后加入5mL甲醇溶液，充分混匀后室温超声60min，4℃条件下，12000rpm离心12min。取上清液浓缩至干后加200μL甲醇复溶，混匀后取上清液过0.22μm微孔滤膜。滤液保存于进样瓶中用于超高效液相色谱—质谱联用(UPLS-MS/MS)分析。1.3仪器及质谱条件色谱条件：仪器采用ThermoVanquish，使用ACQUITYUPLC®HSST31.8µm(2.1u202fmm×150mm)色谱柱。自动进样器温度设为8℃，以0.25mL/min的流速，40℃的柱温，进样2μL进行梯度洗脱。流动相为正离子0.1%甲酸水(B1)-0.1%甲酸乙腈(A1)；负离子5mM甲酸铵水(B3)-乙腈(A3)。梯度洗脱程序为0～1min，2%A1/A3；1～9min，2%～50%A1/A3；9～12min，50%～98%A1/A3；12～13.5min，98%A1/A3；13.5～14min，98%～2%A1/A3；14～20min，2%A1-正模式(14～17min，2%A3-负模式)。质谱条件：仪器使用ThermoQExactivePlus，电喷雾离子源(ESI)。正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为2.50u202fkV。鞘气30arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81～1u202f000，并采用HCD进行二级裂解。碰撞电压为30eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。1.4代谢测定与定量分析基于自建库和公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性分析，分析时去除同位素信号、含K1.5基于mr的峰识别和过滤通过Proteowizard软件(V.3.0.8789)将获得的原始数据转换成mzXML格式，随后利用R(V.3.3.2)的XCMS程序包进行峰识别、峰过滤和峰对齐分析。使用MicrosoftExcel(16.0)软件对质核比、保留时间和峰面积进行统计分析。2结果与分析2.1qc检测结果在进行基于质谱技术的代谢组学研究时，为了获得可靠且高质量的数据，通常需要进行质量控制(QualityControl,QC)。各QC样本的主成分分析(PrincipleComponentAnalysis,PCA)结果如图1左所示。结果显示QC样本密集分布、重复性好、差异小，说明检测系统稳定。为了发现生物标记物，潜在的特征峰在QC样本中的相对标准偏差(Relativestandarddeviation,RSD)不能超过30%。因此，在QC的基础上通常会进行质量保证(QualityAssurance,QA)，QA结果如图1右所示。结果表明RSD小于30%的特征峰比例达到70%以上，说明数据良好。2.2衍生物产物类化合物成分利用UPLC-MS/MS在马尾松、火炬松、湿地松和湿加松4种松花粉组织中共鉴定到368种代谢物成分。其中有机酸类74种、脂质类物质71种、氨基酸及其衍生物66种、糖及醇类物质31种、萜类化合物26种、黄酮类化合物22种、核苷酸及其衍生物类21种、生物碱类14种、维生素10种、酚酸类5种木质素和香豆素类5种、其它类化合物成分23种。部分代谢物成分如表1所示。2.3松树花粉代谢特征在4种松花粉组织的6个比对组中共鉴定到175种差异积累代谢物。其中脂质34种、有机酸34种、氨基酸及其衍生物31种、糖及醇类15种、核苷酸及其衍生物15种、萜类化合物13种、黄酮类11种、生物碱类5种、维生素4种、木脂素和香豆素2种、酚酸类1种、其它类10种。KEGG富集分析结果发现，鉴定到的差异代谢物主要富集于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，黄酮和黄酮醇代谢通路、谷胱甘肽代谢通路及单萜生物合成通路(图2)。显著性差异分析结果发现，共45种代谢物在不同松树的花粉组织中含量差异特异性显著。野黑樱苷、松脂醇、新松香酸、异槲皮苷、香芹酮、前列腺素B2、前列腺素D2、前列腺素H2、前列腺素J2、赤霉素A53和赤霉素A4等31种代谢物在马尾松花粉组织中显著高积累。其中原儿茶酸和神经酸在马尾松花粉组织中特异性积累(图3)。谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺和烟酰胺等7种代谢物在火炬松花粉组织中显著高积累。吲哚乙酰胺和茉莉酮酸甲酯2种代谢物在湿地松花粉组织中显著高积累。纤维二糖、海藻糖和维生素B6等5种代谢物则在湿加松花粉组织中显著高积累(表2)。3基于uplc—讨论与讨论本研究利用UPLC-MS/MS代谢组学技术对2种国外松火炬松和湿地松、1种杂交松湿加松和1种本土松马尾松的花粉组织的代谢物成分进行了鉴定及差异分析。共鉴定出代谢物368种，主要为脂质、有机酸、氨基酸和黄酮等化合物。其中8种人体必需氨基酸，包括亚油酸和亚麻酸在内的多种不饱和脂肪酸；维生素B1、B2、B3、B5、B6和烟酰胺；儿茶素、槲皮苷和异槲皮苷等黄酮化合物；前列腺素A2、B2、C2、D2、E1、F1、F2、G2、H2、I