黄嘌呤缺陷型枯草芽孢杆菌回复突变的性质研究

黄嘌呤缺陷型枯草芽孢杆菌回复突变的性质研究

它也被称为c醇酸乙酰胺钠，是一种优良的化合物。微生物发酵的方法是选育解除了终产物抑制的生产菌株进行直接的发酵生产,通过使用物理或化学的诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的突变菌,然而腺苷生产菌株如果在生产过程中发生回复突变将会降低腺苷产量.回复突变是指突变体经过第二次突变又完全地或部份地恢复为原来的基困型和表型.本实验的目的是探索是生产菌株是否会发生回复突变以及对菌株进行了一系列的性质检测.本实验选用的是黄嘌呤缺陷型的革兰氏阳性枯草杆菌作为腺苷生产菌株,依据是嘌呤核苷酸的从头合成途径为PRPP(5-磷酸核糖-1-焦磷酸)合成IMP(次黄嘌呤核苷酸),再进一步合成AMP(腺嘌呤核苷酸)和GMP(鸟嘌呤核苷酸).一条途径是IMP———sAMP(腺苷酸代琥珀酸)———AMP,另一条途径是IMP———XMP(黄嘌呤核苷酸)———GMP,提高AMP的产量可以切断IMP形成XMP的途径,AMP在包体内最终积累合成AR(腺苷)1材料和方法1.1培养基的制备生产菌株:黄嘌呤缺陷型枯草杆菌(自行筛选培养).试剂:葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、琼脂粉、可溶性淀粉、蔗糖、NaCl,KH培养基配方:完全培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,牛肉膏5g,NaCl5g,pH7.0-7.2、琼脂粉10g、蒸馏水1000ml);LB培养基(蛋白胨1g、酵母提取物0.5g,NaCl0.5g、琼脂1.5g、蒸馏水100ml,pH7.0);高渗透试验培养基(蒸馏水100ml、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、牛肉膏0.5g,NaCl7g,pH7.0-7.2);淀粉水解试验培养基(蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.2g、牛肉膏0.5g,NaCl0.5g、琼脂1.5g、蒸馏水100ml、pH7.2、淀粉先糊状再加入培养基中)硝酸盐试验培养基(蒸馏水100ml、蛋白胨1g,NaCl0.5g、分析纯KNO设备:分光光度计、冷冻离心机、灭菌锅、超净接种台、摇床、恒温箱、超音波粉碎机等.1.2溶氧稳定性测定生产菌株进行2L的上罐发酵培养3天(发酵参数:前2个小时,维持溶氧在5%以上,转速最多400r/m,15分钟调节一次保证溶氧浓度,pH下降到5.8时,改成自动调节pH).每12小时作用取样一次,离心,上清液测定257nm下的吸光度值1.3生产不同时期的细菌、不同时期的保存品种和野生枯草杆菌对照的性质检测1.3.1亚硝酸盐还原试验硝酸盐试验培养基(配方:蛋白胨1g,NaCl0.5g,KNO1.3.2乙酰甲甲醇试验v.p.把菌种接在V.P.培养基上(配方:蛋白胨0.5g,葡萄糖0.5g,K1.3.3整合蛋白及牛肉膏配置高渗试验培养基(蒸馏水100ml,蛋白胨1g,酵母粉0.5g,牛肉膏0.5g,NaCl7g,pH7.0-7.2)1.3.4菌种对淀粉水解过程的检测无菌的淀粉水解培养基(配方:蛋白胨0.5g,可溶性淀粉0.2g,牛肉膏0.5g,NaCl0.5g,琼脂1.5g,蒸馏水100ml,pH7.2)倒平板.用接种针蘸上菌液在培养基上面画一个“十”字.32℃培养48小时后,滴少量碘液在十字周围,观察水解现象,如菌体周围无限无色透明圈,则说明淀粉已经水解,透明圈的大小说明菌种水解淀粉的强弱.1.4酶液的提取菌株接种到LB培养基中,培养过夜.LB培养基(含菌种)倒入大离心管8000r/m离心10分钟,去掉上清液,剩下部分用试剂:Tris-HCl(20mM)+EDTA(1mM)+KCl(10mM)+甘油(5%)洗涤3次,最后一次用10ml试剂溶解,加入溶菌酶(0.5mg/ml),DTT(1mM),装入到小的离心管中,37度下保温15分钟后进行超声波破碎(需冰上操作),得到的溶液8000r/m离心30min,取上清液,保存,即为酶液.酶液中含有很多小分子物质,透析可以得到更纯的蛋白质大分子物质.透析袋的处理:裁剪为合适的长度,用2%的碳酸氢钠+1mM的EDTA煮沸10分钟.用蒸馏水洗干净,再用1mM的EDTA煮沸10分钟,洗干净即可使用.需要保存起来的透析袋用20%的酒精溶液浸泡,置于4度冰箱.把酶液装入透析袋中,用橡皮筋扎好,浸泡到Tris-HCl(20mM)+EDTA(1mM)+KCl(10mM)+甘油(5%)的溶液中,24小时,最好每隔8个小时更换一次溶液.1.5酶活性测定1.5.1imp脱氢酶活性测定IMP脱氢酶来自于产气杆菌,IMP会发生下面这个反应:IMP+NAD1.5.2腺苷脱氨酶活性测定试剂:A:20mMTris-HCl,1mMEDTA,10mMKCl,5%甘油;试剂B:1.35mM腺苷溶液(Mw=267),pH7.025C(用腺苷制备10ml腺苷,用10mMNaOH调节pH为7.0,温度25C);试剂C:腺苷脱氨酶溶液.在空白和样品中均加入去离子水1.3ml+试剂A1.55ml+试剂B0.1ml;混合均匀,25C保温,持续测定OD值,OD值稳定后,空白中加入试剂A0.05ml,样品中加入试剂C0.05ml,之后连续5min内记录A265的减少,得到样品和空白的线性范围内的最大ΔA1.5.3黄黄破坏酶活性测定次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成黄嘌呤.在比色杯中分别加入去离子水2.2ml+100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)600ul+1.5mM的黄嘌呤溶液(0.23g/L)100ul+96U/L的酶液100ul.(酶液预热),酶一加入立即精确计时并摇匀,测定265nm处吸光度的变化,记录初始OD值,之后每0.5min记录一次数据,共反应5min.空白管中不加底物,同样测定.以反应时间为横坐标,OD2结果与分析2.1选择突变菌株生产菌株的选育方法参见《黄嘌呤缺陷型枯草杆菌的选育》2.2野生枯草杆菌和生产菌株随机挑选记号为菌种c,e,g,h,m(其中c、e菌种为43小时取样菌种,另外3个为31小时取样菌种),以及野生的枯草杆菌(标记为枯)和生产菌株(标记为2C).2.2.1回复突变菌株的性质图中能够清楚观察到生产菌株和空白对照为阴性,而上罐发酵时取样出的菌种都呈阳性(m菌株的颜色最深),和野生的枯草杆菌一样,所以我们可以推断,回复突变的菌株c,e,g,h,m在硝酸盐试验中和野生菌株的性质是一样的.2.2.2回复突变菌株的形态和图2.1的硝酸还原试验对比来看,仍然是m的颜色最深,而c的颜色最浅,2C以及空白对照都是阴性反应,回复突变的菌株在性质上和野生的菌株是相类似的.2.2.3在高渗下生存测试见表2.2中，生长条件良好2.2.4通过淀粉水分析试验见表2.3，可以清楚地观察到交叉口周围有一个明显的透明圆圈2.3酶活性检测2.3.1imp脱氢酶活性测定IMP+NAD从图2.3中看出,290nm下的黄嘌呤消光系数非常低,而尿酸有一个最大值1.22×102.3.2亚硝酶ec3.3.4.4的测定活性原始数据如表2.6,线性拟合,用units/ml=(ΔA2.3.3单位酶活测定265nm,黄嘌呤摩尔消光系数10.25×103M-1?cm-1.酶活定义为单位时间催化1μmol产物生成的酶量,每分钟单位酶活=(ΔA3腺苷回复突变实验和回复突变菌株的筛选把菌种的3个酶活比较(见表3.1),除了生产菌株和m菌株外,其余菌株都具有IMP脱氢酶活性,说明在生产过程中确实有很多菌种发生了回复突变.所有的菌株都不具有AMP脱氨酶活性,但全部具有黄嘌呤氧化酶活性,并且生产菌株和突变菌株的活性远大于野生菌株.本实验发酵后期发现,腺苷的产量增加不上去,说明菌种大量回复