参与DNA复制有关的酶和蛋白质

参与DNA复制有关的酶和蛋白质

现在已经知道约20多种蛋白质参与复制。〔1〕聚合酶〔2〕解链、解旋酶类〔3〕引发酶〔4〕连接酶下表是与大肠杆菌复制有关的蛋白质。蛋白质名称分子量×103U亚基数

功能每个菌中的分子数毫克蛋白质公斤细胞〔湿重〕SSBi蛋白n蛋白n′蛋白n″蛋白dnaCdnaB引发酶7480257511293006044111161与单链结合预引发预引发部位识别,ATPase预引发预引发移动启动子,ATPase引发合成300503070-1002050

200.50.30.30.2表与大肠杆菌复制有关的蛋白质接下页BACK蛋白质名称分子量×103U亚基数

功能每个菌中的分子数毫克蛋白质公斤细胞〔湿重〕PolⅢ全酶αεθβγδτ1402510375232831121211链的延长30020

0.5PolⅠ1091填补缺口和切去引物30010连接酶741连接30010拓扑异构酶Ⅱαβ400210190422引进超螺旋_25025rep蛋白解链酶ⅡdnaA65754811解开双链复制起始5050002000.6Rep蛋白是一种大肠杆菌解链酶1DNA聚合酶

DNA聚合酶

是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。

全称：DNA依赖的DNA聚合酶〔DNA-dependentDNApolymerase〕简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它们催化脱氧核苷三磷酸加到复制中的DNA链的3ˊ羟基末端，合成方向从5ˊ→3ˊ，由模板决定加上何种脱氧核苷酸。

5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突变的DNA片段和RNA引物。能识别错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性

目录DNA聚合酶的分类DNA-polⅠ主要的修复酶DNA-polⅡ次要的修复酶DNA-polⅢ复制酶DNA-polIVSOS修复DNA-polVSOS修复原核生物的聚合酶

〔1〕大肠杆菌DNA聚合酶I〔PolⅠ〕

纯的DNA聚合酶I由分子量109000U〔109KD〕，含928个氨基酸残基的一条肽链构成，每个大肠杆菌细胞中大约含400个酶分子。〔单链多肽〕

功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。323个氨基酸小片段〔34KD〕5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段〔76KD〕604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶DNA-polⅠ

DNA聚合酶Ⅰ的多种活性。①5′→3′聚合活性：在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底物在引物3ˊ-OH末端加上脱氧核苷酸。每个酶分子每分钟添加1000个单核苷酸。聚合酶催化的DNA的合成需要以下条件：

▲模板

▲

四种脱氧核苷酸▲必须有一3′-OH末端的引物，且此引物必须与模板正确形成氢键

▲合成从5ˊ→3ˊ方向进行，如图7-8和图7-9所示②3′→5′外切酶活性：

没有脱氧核苷三磷酸底物时，DNA聚合酶I能从3′-OH开始以3′→5′方向水解DNA，产生5ˊ-单核苷酸。实际上DNA复制时，加上去的脱氧核苷酸不一定每次都正确，错误的时机不少，有时甚至加上一个不与模板配对的核苷酸，当3ˊ-OH末端的碱基不与模板配对时聚合酶就无聚合活性，此时它具有的3ˊ→5ˊ外切酶活性可以切除这个不配对的核苷酸，这一碱基切除后，外切核酸酶活性终止，聚合酶活性恢复，如图7-10所示。所以聚合酶的3ˊ→5ˊ外切酶活性也叫修补活性。

③5′→3′外切酶活性：

DNA聚合酶I具有5′→3′外切酶活性。如图7-11，其特点是：

▲只能在5ˊ-P末端一个接一个地切除核苷酸；

▲能连续地切除多个核苷酸；

▲只切除配对的5ˊ-P末端核苷酸，不切除不配对的单链5ˊ-P末端核苷酸；

▲既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸；

▲对只具有5ˊ-P末端的切口也有活性〔由于在DNA复制过程中一般情况下只在RNA引物处才有缺口，因此5′→3′外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物〕。

切口翻译〔nicktranslation〕DNA聚合酶I的5ˊ→3ˊ外切酶活性和聚合活性同时作用可以进行切口翻译〔nicktranslation〕，用来制造放射性探针。在反响物里参加同位素标记的脱氧单核苷酸，DNA聚合酶I首先利用5ˊ→3ˊ外切酶活性，从切口处逐个切下DNA上的核苷酸，再利用3ˊ-OH末端聚合作用逐个将标记的核苷酸加上去〔图7—12〕。5'3'5'3'④内切酶活性：

DNA聚合酶I也具有5ˊ→3ˊ内切酶活性，如图7-13所示。在两个碱基之间切开产生一个具有5ˊ-P末端的不配对碱基的片段。很多实验证明DNA聚合酶I在大肠杆菌复制中不是主要的合成酶，而是在除去RNA引物和损伤修复中起重要作用。

不配对的片段内切酶活性

〔2〕

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这说明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现了DNApolⅡ。

①

从5′→3′方向合成DNA

②具有3ˊ→5ˊ外切酶活性，但没有5ˊ→3ˊ外切酶活性。在体外的合成速率比体内的速率要低得多，带有这个酶缺陷的大肠杆菌突变株染色体的复制各方面都正常，它在体内的功能可能和DNA聚合酶I类似。

〔3〕大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ

▼聚合酶Ⅲ是体内DNA复制所必需的酶

带有DNA聚合酶Ⅲ的温度敏感突变〔polc〕的大肠杆菌在限制温度下是不能存活的，从这种菌株得到的裂解液也不能合成DNA，当参加正常细菌的DNA聚合酶Ⅲ时可以恢复它的聚合能力，因此不同于DNA聚合酶I和Ⅱ，聚合酶Ⅲ是体内DNA复制所必需的酶。

DNA多聚酶Ⅲ相当复杂，其结构和各亚基的功能如图11－24，25所示。

DNApolⅢ具有5'→3'聚合功能。

DNA聚合酶Ⅲ的“核心酶〞由α、ε、θ三种亚基组成。

α亚基具有合成DNA的能力。

ε亚基具有3‘→5’外切酶的功能，起到校正的作用。

θ亚基可能在组装中发挥功能。τ亚基加到核心酶上使其二聚化，进一步产生polIII※。γ复合体参加到polⅢ※，进一步形成polⅢ′复合体。

γ复合体是由γ，δ，δ′，χ和ψ亚基组成，其作用是固定β亚基这个“夹子〞的支架。亚基β：形成夹钳，保持催化核心和模板链的结合▼聚合酶Ⅲ的活性聚合活性：DNA复制时聚合酶Ⅲ全酶十分重要，它可以在DNA模板上的引物的3′-OH上以每分钟约50000核苷酸的速率逐个延伸新生的DNA。

3′→5′和5′→3′的外切酶活性：

polⅢ的5′→3′外切酶活性与polⅠ的不同，polⅢ的5′→3′外切酶活性只对单链

DNA有作用，因此不能用于缺口翻译。

DNA聚合酶Ⅲ的作用范围如图7-14所示。

催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数+-+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶〔4〕真核生物中的DNA聚合酶所有真核生物中的聚合酶的性质基本上同大肠杆菌中的聚合酶相似，它的活性有赖于模板，带3′-OH的引物，四种脱氧核糖核苷磷酸。目前发现的真核生物DNA聚合酶有αβγδε

。

DNA聚合酶α：在迅速增殖的细胞中活力较高。酶分子量在165,000一175,000U之间。最适宜的底物是带缺口的双链DNA，但是带引物的变性DNA也是很好的底物。是真核生物的复制酶。它同大肠杆菌DNA聚合酶最大不同之处在于不具外切酶活性。

DNA聚合酶β〔损伤修复〕：为分子量较小〔43,000U〕的聚合酶。在整个细胞周期中它的活力没有变化，它利用DnaseI处理过的天然DNA作模板，对变性DNA几乎没有活性，不具外切酶的活性。

DNA聚合酶γ〔线粒体〕：是一个大分子酶，在细胞内含量很低，因此不容易纯化。这个酶可以使用带缺口的DNA作底物，但以多聚〔A〕、寡聚〔dT〕8-10作为底物，酶活力更高。DNA聚合酶γ负责线粒体DNA的复制。

DNA聚合酶α和DNA聚合酶δ〔主要复制酶〕:是真核生物的复制酶，主要根据是聚合酶δ的活性随细胞周期而变化。

DNA聚合酶ε：功能不详。

2DNA连接酶DNALigase

DNA连接酶催化一个DNA链的5′磷酸根与另一DNA链的3′羟基形成磷酸二酯键。

但两个链都必须与同一另外的链互补结合，而且两链必须相邻，即只能连接一个切口〔nick〕而不能连接一个豁口〔gap〕〔丧失核苷酸〕，如图7-15所示。例子：T4诱导的连接酶不仅能在模板上连接DNA和DNA之间的切口，也能连接RNA和RNA之间的切口，不仅能连接DNA中的单链切口或双链的粘性末端，而且能连接平头双链DNA。大肠杆菌连接酶则不行。3与解链有关的酶和蛋白质

DNA是双螺旋，在复制中双螺旋要解开，双螺旋的解开使得复制叉前面产生正超螺旋，如果这些应力不以某种方式释放将阻碍复制叉前进。现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使DNA双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介绍一些这类蛋白质。〔1〕单链结合蛋白〔SSB蛋白〕

SSB蛋白：是缺乏酶活性的复制辅助蛋白，可以在远低于Tm的温度下使双链DNA拆开，并牢牢地结合在单链DNA上，稳定单链区域的蛋白质。〔SSB保护复制中的DNA单链局部不被核酸酶降解〕首先在大肠杆菌中发现，后来发现许多种生物中都有这类蛋白质。在文献中，这类蛋白曾用过多种名称：解旋蛋白〔unwindingproteill〕，熔化蛋白〔mel2ingprptein〕，螺旋降稳蛋白〔helixdestabizingprotein〕。

〔2〕解链酶〔DNA解旋酶；DNAhelicases〕

解链酶〔解螺旋酶〕：是一类能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA的酶称为DNA解链酶。

▼解链酶依赖于单链DNA的存在

▼分解ATP获得能量

▼具引发酶的功能〔合成小片段的RNA作为后随链的引物〕如果双链DNA中有单链末端或缺口，则DNA解链酶可以首先结合在这一局部，然后逐步向双链方向移动，复制时大局部DNA解链酶可以沿着后随链模板的5′→3′方向随着复制叉的前进而移动，只有rep蛋白〔一种大肠杆菌解链酶〕是沿前导链模板的3′→5′方向移动。因此在复制时rep蛋白和某DNA解链酶分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA〔图7-16〕〔3〕拓扑异构酶〔Topoisomerase〕：是催化DNA拓扑异构体〔Topoisomer〕相互转换的一类酶。拓扑异构酶能与DNA形成共价结合的蛋白质-DNA中间体，从而在其骨架的磷酸二酯键处造成暂时性裂口，使DNA的多核苷酸链得以穿越，从而改变DNA分子的拓扑状态。根据酶作用的机理及其介导一条链还是二条链的断裂，拓扑异构酶可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型拓扑异构酶的共同特点是：①仅切断双链DNA中的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接。②不需要能量辅助因子，如ATP和NAD等，因此不能催化需能的超螺旋化结构。Ⅰ型拓扑异构酶一般都使高度超螺旋的DNA松弛。

Ⅱ型拓扑异构酶的共同特点是：①同时切断、缝合DNA的两条链。②需要能量辅助因子，可以作用于任何相交的两对双链DNA。

大肠杆菌拓扑异构酶I〔属于Ⅰ型酶〕

概述：拓扑异构酶Ⅰ

〔E.coli〕催化负超螺旋DNA的松弛。①拓扑异构酶Ⅰ也参与DNA的打结和解结。②将两个互补的单链DNA环耦合为双链DNA环。③完整的全酶是一分子量97kDa的蛋白。

大肠杆菌拓扑异构酶I的特点是：

①仅切断双链DNA中的单链并催化瞬时的单链断裂和连接。由于反响的产物还是闭环DNA，因此，酶反响机制是先切开双链DNA中的一条链，使切开链的末端沿螺旋的方向转动，然后把切口封起来，到达松旋的目的。

②不需要能量辅助因子。如：ATPNAD〔烟酰胺腺嘌呤二核苷酸〕

，最初从大肠杆菌中别离到一种叫ω蛋白，后来定名为大肠杆菌拓扑异构酶I。StructureoftheTopoI/contactwithDNA

后来发现这种酶广泛存在于各种生物中，不同学者曾给予各种命名：转轴酶〔swivelase〕，松旋酶〔untwistingenzyme〕，DNA松弛酶〔DNArelaxingenzyme〕，切割封口酶〔nicking—closingenzyme〕。

TopoI酶松弛超螺旋DNA时不需要ATP，它可以催化三种拓扑转换反响〔图7-17〕。拓扑异构酶I〔E.coli〕催化负超螺旋DNA的松弛。拓扑异构酶I也参与DNA的打结和解结。

将两个互补的单链DNA环耦合为双链DNA环。TopoIReactions①仅切断双链DNA的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接，②不需要能量辅助因子如ATP和NAD等TopoI作用机制23图2-21拓扑异构酶Ⅰ的作用机制

拓扑异构酶Ⅱ〔属于Ⅱ型酶〕

概述：TopoⅡ广泛存在于各种生物中，它是完成复制所必需的一种酶，可使完成复制后的两个子代环状双链DNA互相分开。

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅱ的共同特点是：①同时切断、缝合双链DNA的两条链，不需要单链切口存在，它使松弛的双股环型DNA转化为负超螺旋