植物细胞工程技术原理专家讲座

第11章植物组织培养

（PlantTissueCulture)植物细胞工程技术原理专家讲座第1页主要内容组织培养理论基础组织培养技术操作影响组织培养效果原因植物细胞工程技术原理专家讲座第2页第一节组织培养技术操作组织培养技术流程？组织培养1选择植物材料2培养基5培养(温度控制等）4接种3灭菌植物细胞工程技术原理专家讲座第3页一、培养基及其配制培养基组成成份培养基分类培养基配制植物细胞工程技术原理专家讲座第4页1、培养基组成成份最早风眼兰栅栏组织Knop溶液+蔗糖存活不分裂1934年White番茄根离体培养成功（1937年发觉B族维生素作用，创建White培养基）1948年Skoog和崔真烟草茎段培养发觉腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长抑制作用培养基组成：水、无机盐、糖、有机物、植物激素、其它添加物等。植物细胞工程技术原理专家讲座第5页1、培养基组成成份糖：碳源，维持培养基渗透压3%（2~6%）无机盐：普通有10~20种，分为大量元素和微量元素两类。大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo一个离子普通由一个以上无机盐提供，以确保离子平衡，防止因为培养物吸收差异引发pH变动。植物细胞工程技术原理专家讲座第6页1、培养基组成成份有机物：维生素类

VitB1（硫胺素）VitB6（盐酸吡哆醇）VitB3（烟酸）VitB5（泛酸钙）

肌醇

氨基酸

CH（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白）

ME（麦芽提取物）、YE（酵母浸出物）植物细胞工程技术原理专家讲座第7页1、培养基组成成份植物激素：生长素类：诱导细胞分裂和根分化；IBA、IAA、NAA、2,4-D

0.1mol/LNaOH配制细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化不定芽6-BA、KT、ZA、2iP

0.5或1mol/LHCl配制植物细胞工程技术原理专家讲座第8页1、培养基组成成份其它添加成份：固化剂（gellingagent）：琼脂用量普通为7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。吸附剂：活性碳，适合用于培养中轻易形成不利于生长分泌物培养物。植物细胞工程技术原理专家讲座第9页pH变动高中化学：无机盐溶液酸碱性判断依据是，该盐是否发生水解。强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强碱弱酸盐如Na2CO3碱性。大学：植物对矿质元素吸收是以离子形式进行，以交换吸附方式发生，阳离子和H+发生交换吸附；阴离子和HCO3-13种必需矿质元素吸收量存在以下关系：大量元素：N＞K＞Ca＞Mg=P＞S；微量元素：Cl=Fe＞Mn＞B＞Zn＞Cu=Mo(NH4)2SO4中，吸收量N＞S，培养基中H+多，生理酸性盐，pH减小KNO3中，N＞K，HCO3-多，生理碱性盐，pH增大。植物细胞工程技术原理专家讲座第10页2、培养基分类按性质分：基本培养基完全培养基：基本培养基加激素按状态分固体培养基液体培养基植物细胞工程技术原理专家讲座第11页2、培养基分类基本培养基按照组成成份又可分为很各种，常见如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。依据其盐浓度大致可分为四类：富盐平衡培养基：MS高硝态氮培养基：B5、N6中盐培养基：Miller，大量元素浓度为MS二分之一低盐培养基：White，生根培养植物细胞工程技术原理专家讲座第12页3、培养基选择查阅文件资料，参考已经有研究结果选择基本培养基确定激素种类和浓度（配方）自己试验植物细胞工程技术原理专家讲座第13页4、培养基配制（1）、母液配制：母液：实际是一个贮存液，比实际使用溶液浓度高。方便，准确。以KNO3为例：1L培养基需要量为19g，在配制母液时，增加为10倍量即190g，这么用母液配制培养基时，只要1/10母液量就能够了。植物细胞工程技术原理专家讲座第14页4、培养基配制（1）、母液配制：普通把母液分成大量元素、微量元素、有机物等几类进行配制。大量元素配制成10-20×母液微量元素配制成100-200×母液有机普通配制成100×母液激素单独配制成1mg/ml母液

植物细胞工程技术原理专家讲座第15页4、培养基配制2、培养基配制称取适量糖（固体培养基还需要琼脂），溶解依据要配制培养基体积按百分比加入所需体积母液（如有琼脂则需煮沸至澄清）加入激素，定容（热不稳定激素需灭菌后加入）调整pH值为5.8~6.0（这一步一定要最终操作）植物细胞工程技术原理专家讲座第16页二、灭菌灭菌、消毒、防腐物理方法：热力灭菌干热160度2h玻璃和金属器皿湿热高压蒸汽灭菌都适用电离辐射：各种射线一次性器械和物品如注射器紫外灭菌：紫外线照射20~30min空气和物体表面消毒植物细胞工程技术原理专家讲座第17页二、灭菌化学方法：重金属盐如0.1%HgCl2氧化剂如高锰酸钾、10%NaClO表面活性剂：酒精、洁尔灭甲醛等植物细胞工程技术原理专家讲座第18页二、灭菌过滤除菌：适合用于不能经过高温高压灭菌物质，应用各种细菌过滤器灭菌。针头式滤器、正压式金属滤器植物细胞工程技术原理专家讲座第19页二、灭菌接种室和培养室：定时熏蒸灭菌熏蒸剂惯用甲醛加高锰酸钾，普通每100ml甲醛加5g高锰酸钾植物细胞工程技术原理专家讲座第20页三、外植体选取及接种培养1、外植体（explant）选取外植体：是指用于离体培养活植物组织、器官等材料。用于外植体分离母体植物材料普通有三种起源：一是生长在自然环境下植物；二是有目标地培育在温室控制环境条件下生长植物；三是无菌环境下已经过离体培养植物。植物细胞工程技术原理专家讲座第21页二、外植体选取及接种培养1、外植体（explant）选取依据培养需求选择植物部位

多年生植物注意树龄和季节

在不影响培养目标前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体植物细胞工程技术原理专家讲座第22页2、外植体灭菌1、惯用消毒剂及特点消毒剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易次氯酸钙/纳105～30好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～10最好最难过氧化氢10～125～15很好最易抗菌素4～50mgl-130～60很好较难植物细胞工程技术原理专家讲座第23页不一样外植体在灭菌剂浓度、时间、程序上有所区分2、外植体灭菌消毒剂筛选设计？植物细胞工程技术原理专家讲座第24页2、外植体灭菌灭菌程序及筛选外植体清洗整理杀菌剂灭菌无菌水清洗不一样外植体在灭菌剂浓度、时间、程序上有所区分准备室超净台上70%酒精1minNaClO/HgCl2洗4~5次植物细胞工程技术原理专家讲座第25页3、接种用解剖刀、镊子将外植体分割成适当大小于酒精灯旁打开培养瓶盖用灭过菌镊子将外植体接入培养基中盖培养瓶盖，注明材料、日期等信息。培养植物细胞工程技术原理专家讲座第26页4、培养温度：24℃左右普通材料20~30℃光照：早期弱光，后期强光；光周期普通12~16小时气体调整（O2）：植物细胞工程技术原理专家讲座第27页四、常见污染及原因污染原因：培养基、器具灭菌不彻底；培养材料消毒灭菌不彻底；无菌操作不过关；培养时污染（与培养室相关）。常见