体细胞胚及人工种子

第一节体细胞胚概念及其发生路径第二节人工种子体细胞胚及人工种子体细胞胚及人工种子第1页第一节体细胞胚概念及其发生路径体细胞胚胎发生意义体细胞胚胎发生概念体细胞胚胎发生方式体细胞胚胎起源体细胞向胚性转变制机体细胞胚胎发育成植株能力影响体细胞胚胎发生原因举例：落叶松体细胞胚胎发生体细胞胚及人工种子第2页体细胞胚胎发生意义“HowdoesaSingleSomaticCellBecomeAWholePlant”(怎样使一个单细胞发育成一棵完整植株，是世界科学必须处理问题)是年SCIENCE杂志上提出世界科学界25大问题之一(Oneof25“Whatdon’tweknow”inSCIENCE

Vol309,1July)林业上，体细胞胚胎发生是限制林业产业化和无性系化关键技术，更是世界林业优良针叶树新品种实现快速繁殖主要伎俩。下一张体细胞胚及人工种子第3页返回体细胞胚及人工种子第4页

在应用上，体细胞胚胎发生是进行遗传转化、种质保留、快速繁殖、生理生化基础研究等主要伎俩；它也是基因工程桥梁，在林木大量繁殖、品种改良、林木更新、沙漠改造等方面都有很大现实意义和经济效益。尤其对于针叶树难以无性繁殖树。体细胞胚及人工种子第5页自1985年，第一例针叶树体细胞胚发生以来，国内外经过体胚发生取得完整植株有一些报道和专利，取得很大进展；Hakman首次报道挪威云杉未成熟胚形成体细胞胚并再生植株以来，国内外已从30各种不一样针叶树培养产生了体细胞胚（Tautorus,1991），，迄今为止，已经有加勒比松(JainS.M.,1989)、糖松(GuptaP.K.，DurzanD.J.,1986)、火炬松、（BecwarM.R.,1989）

落叶松体细胞胚及人工种子第6页

美国Weyerhaeuser企业用1升三角瓶液体培养黄杉、火炬松、挪威云杉ESM（embryo-genicsuspensormass）培养物，用这套系统生产了1千多棵黄杉再生植株和4千多棵挪威云杉再生植株；美国WESTVACO企业火炬松、新西兰辐射松、加拿大CELLFORFORESTRY企业云杉、冷杉、花旗松等都致力于经过体细胞胚胎发生路径进入规模化生产；澳大利亚林业部门已集中力量研究实施日益发展商业化微繁技术；泰国柚木改良中心，每年能培育出200万株生物苗;加拿大锡尔巴杰企业研究使用不定胚生产云杉生物苗;日本正在研究不定胚生产人工种子;新西兰辐射松纯林大都是利用生物苗营造,现在塔斯曼林业企业每年可产250-300万株生物苗,这是世界林业大有希望领域。体细胞胚及人工种子第7页不论用常规方法，还是生物技术，都应该向产业化方向发展，对针叶树种来说，常规方法很慢，体细胞胚胎发生则可在短期内快速扩大数量体细胞胚及人工种子第8页体细胞胚发生存在问题早萌问题同时化问题体细胞胚不生根下胚轴不伸长子叶发育不正常体细胞胚及人工种子第9页体细胞胚（somaticembryo）又称胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成胚胎类似物。一、体细胞胚概念体细胞胚及人工种子第10页花粉培养单细胞悬浮培养原生质体培养组织器官培养体细胞胚花粉胚非合子胚非合子细胞合子胚无融合生殖胚**大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（pollenembryogenesis）**前者为二倍体体细胞产生胚状结构

**后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生体细胞胚，通常称花粉胚（pollenembryos），可发育成单倍体植株。体细胞胚发生体细胞胚及人工种子第11页体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成胚状结构，包含以下几点含义：1、体细胞胚是组织培养产物，区分于无融合生殖胚，只限于在组织培养范围使用；2、体细胞胚起源于非合子细胞，区分于合子胚；3、体细胞胚形成经历胚胎发育过程，区分于组织培养器官发生中芽与根分化。体细胞胚及人工种子第12页植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比含有显著特点：

1、含有两极性2、存在生理隔离3、重演受精卵形态发生特征体细胞胚及人工种子第13页**植物组织培养过程中植物体细胞胚胎路径可归纳为两类：直接路径和间接路径。**直接路径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成**间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成体胚一组细胞中发育而成，如香雪兰（Freesiarefracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生路径形成再生植株。二、体细胞胚胎发生方式体细胞胚及人工种子第14页1直接路径

直接发生体胚起源细胞能够是外植体表皮、亚表皮、幼胚、悬浮培养细胞和原生质体。普通认为直接方式发生体胚是由原先就存在于外植体中胚性细胞――预胚胎决定细胞（PEDCs）培养后直接进入胚胎发生而形成体胚，如柑桔属珠心组织（在体内或离体情况）经过预胚胎决定细胞直接进行体胚发生最好例子.

2间接路径间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化细胞先脱分化，并对其发育命运重决定而诱导出胚性细胞――诱导胚胎决定细胞（IEDCs），进而形成体细胞胚。体细胞胚及人工种子第15页1茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织MS培养基附加2.0mg/L2,4-D2胚性愈伤组织悬浮培养增殖MS培养基附加2.0mg/L2,4-D3由细胞集合体形成体细胞胚MS培养基附加2.0mg/L2,4-D4体细胞胚萌发并形成小植株MS培养基附加1.0mg/LABA图甘薯品种栗子香胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株体细胞胚及人工种子第16页胚性愈伤组织非胚性愈伤组织颜色淡黄白色表面光滑粗糙质地坚硬但易碎涣散，水渍状胚性细胞多少大量极少或无细胞形态小，圆球形管状或不规则形细胞质浓厚，染色深稀薄，染色浅内含物多少细胞核及核仁核显著，大，核仁多核小，核仁少，或无核胚性细胞团特征：成簇、成团，体积小，细胞质致密体细胞胚及人工种子第17页三、体细胞胚起源体细胞胚胎发生路径有直接路径和间接路径，但不论哪一个发生路径，绝大多数研究报道认为体细胞胚胎起源于单细胞,从各种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂二细胞原胚和均等分裂二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究认为起源于多细胞。体细胞胚及人工种子第18页在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上能够观察到多个不一样发育时期体细胞胚，从单个原始细胞到多细胞原胚、球形胚、鱼雷胚直至具子叶胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂不一样时所致。香蕉：心形体细胞胚可可：心形胚A和球形胚BAB1体细胞胚单细胞起源体细胞胚及人工种子第19页a)胚性细胞第一次分裂；b-d)原胚第一次细胞分裂，鳄梨树形胚柄细胞仍保持单个细胞；e)胚柄细胞开始增殖；f-k)原胚和胚柄发育不一样时期；l)球形体细胞胚。(ep)=原胚；(s)=胚柄图仙人掌科体细胞胚胎早期发育（由单细胞形成球形胚时期）体细胞胚及人工种子第20页有学者观察到体细胞胚起源于多细胞组成胚性细胞复合体，王亚馥等人也观察到这种胚性细胞团，但用同位素脉冲标识试验即可证实这些细胞团也是由一个单细胞连续分裂而形成，经深入分化和分裂形成不一样发育时期体细胞胚，因而这些体细胞胚实质也可能是起源于单细胞。当然也不排除有些植物体细胞胚确实是起源于多细胞，仍有待深入研究。总之，体细胞胚胎发生是一个非常复杂生理过程，仍有许多问题尚需深入研究。2体细胞胚多细胞起源体细胞胚及人工种子第21页四、体细胞转变为胚性细胞机制**合子胚起源于受精卵；体细胞胚是非合子胚，未经过雌雄配子受精这一过程，SomaticEmbryos又是怎样形成？机制是什么？**体细胞胚不论起源于哪一个细胞，都存在着一个共同问题，即体细胞是怎样转变为胚性细胞而形成体细胞胚。大量研究事实表明，植物细胞在一定培养条件下，具胚胎发生能力可能是一个普遍现象。

体细胞胚及人工种子第22页1体细胞胚发生理论—渐变理论（1）体细胞胚胎发生实质**体细胞胚胎发生实质是细胞分化问题，而细胞分化分子基础则是基因差异表示与调控结果。相关细胞分化分子机制有许多理论，其中最具普遍性是渐变理论，认为一个细胞系细胞质因子间相互作用是一个原发稳定基因组中基因活化结果，从而使该细胞系与其它细胞系不一样。外植体脱分化愈伤组织细胞分化胚性细胞非胚性细胞基因调控体细胞胚及人工种子第23页（2）渐变理论认为细胞分化可分为几个阶段？分为两个阶段：第一阶段为预定阶段，细胞接收了或预定了特殊发育命运，但并未表现出可见特化标志，这种特征一旦建立就能够在细胞继代培养中得以稳定保持。第二阶段是表示阶段，在适宜条件诱导下，预定细胞（pro-embroygenicdeterminedcells,PEDC）发生一系列生理生化和形态上改变，表现出分化特征，但因为这种表示与培养过程中诱导原因关系亲密，而表现为一个生理反应，是不稳定。（3）渐变理论不足（一）未揭示体细胞胚胎发生实质，以及细胞预定性是怎样实现问题。（二）不能解释经屡次继代培养细胞往往会失去胚胎发生能力，因其理论认为预定性细胞在以后培养过程中处于稳定状态。（三）不能解释体细胞胚胎直接发生路径和间接发生路径可因条件不一样而相互转化问题。体细胞胚及人工种子第24页**按预决定观点，从外植体组织或细胞直接形成体细胞胚路径，需要一个诱导物合成或抑制物消除，来恢复有丝分裂活动和促进胚胎发育。这时生长素对胚胎发生常起抑制作用，去掉生长素并给以必要条件就使细胞进入分裂周期，并进行胚胎发生表示。**从外植体经过脱分化形成愈伤组织，间接产生体细胞胚路径，则需要分化细胞重新预决定，称为诱导胚胎预决定细胞（inducedembroygenicallydeterminedcells,IEDC），这时则需要生长素，诱导细胞进入细胞周期。生长素不但作为使细胞发生分裂所必需物质，而且也是使细胞进入胚胎状态所必需原因。（4）按预决定观点，生长素对由直接路径和间接路径体细胞胚发生作用体细胞胚及人工种子第25页五、体细胞胚发育成植株能力1体细胞胚发育成植株能力**普通来说胚胎一旦被分化出来或甚至完成诱导之后转移到基本培养基上即可发育成熟，并可形成小植株。**如陈东方等（1986）对棒头草幼穗培养研究表明，体细胞胚形成之后，能够在原来培养基上或MS无任何附加成份培养基上以及1/2MS加IAA或NAA0.5mg/L和6-BA0.5mg/L培养基上萌发形成小植株。体细胞胚及人工种子第26页1茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织MS培养基附加2.0mg/L2,4-D2胚性愈伤组织悬浮培养增殖MS培养基附加2.0mg/L2,4-D3由细胞集合体形成体细胞胚MS培养基附加2.0mg/L2,4-D4体细胞胚萌发并形成小植株MS培养基附加1.0mg/LABA图甘薯品种栗子香胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株体细胞胚及人工种子第27页2体细胞胚萌发两种不正常现象体细胞胚萌发时观察到两种不正常萌发觉象：**一个是不完全萌发，即只有芽而无根或只有根而无芽.**另一个是早熟萌发，即体胚还未表现出完整胚结构之前就已萌发，萌发时盾片膨大形成一叶状体，在叶状体基部长出芽。注意：体细胞胚胎路径形态发生能力要比器官分化路径保持更长久。体细胞胚及人工种子第28页六、影响体细胞胚发生原因基因型与体细胞胚发生基因型是影响体细胞胚发生主要原因，体细胞胚诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚发生率因基因型而异。体细胞胚及人工种子第29页（a）不一样基因型体细胞胚诱导率；（b）不一样基因型每个胚性外植体上体细胞胚数目图6.7在相同培养基上FeijoasellowianaBerg不一样基因型体细胞胚诱导（引自Miguel等，）体细胞胚及人工种子第30页2、植物激素与体细胞胚发生**离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂素能力，不过在大多数情况下，这些细胞分裂和分化以及形态建成过程中又必需生长素和细胞分裂素两种激素共同作用。**在培养介质中添加不一样种类或不一样浓度外源激素诱导形态发生已受到广泛重视。**但最关键是组织内部和体细胞胚发生部位内源激素代谢动态和平衡。体细胞胚及人工种子第31页早在胡萝卜细胞悬浮培养体细胞胚发生中发觉，2，4-D在诱导胚性细胞早期是必需，而且2，4-D是经过影响IAA结合蛋白起作用，其实质是促进IAA结合蛋白形成，提升细胞对IAA敏感性从而诱导胚性细胞形成。水稻细胞培养中也发觉，因为2,4-D促进细胞内源IAA含量提升进而诱导胚性细胞形成，并认为内源

IAA

含量上升或维持在较高水平，是胚性细胞出现一个共同标志。一些研究表明，ABA

对植物体细胞胚发生与发育含有主要作用。外源ABA与内源ABA对体细胞胚发生起到相互调整和促进作用，而且经过补充提升外源ABA，能够显著提升体细胞胚发生频率与质量。荔枝体细胞胚胎发生早期内源激素ABA与IAA和ABA与CTK（细胞分裂素）质量比增大，将有利于荔枝体细胞球形胚形成。（1）内源激素与体细胞胚发生体细胞胚及人工种子第32页①2，4-D与体细胞胚发生2，4-D是诱导各种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞主要激素。单子叶植物和双子叶植物诱导体细胞胚胎发生时，所要求2,4-D浓度不一样，对单子叶植物而言，普通要求较高浓度2,4-D，其浓度范围为0.5-5mg/L，通常使用浓度为2mg/L；而对双子叶植物而言，普通要求较低浓度2,4-D，其浓度范围为0.02-1mg/L，通常使用浓度为0.1mg/L。在体细胞胚胎发生诱导阶段，培养基中必需添加2,4-D，而在体细胞胚胎形成阶段，要降低培养基中2,4-D浓度或去除2,4-D，以确保体细胞胚正常生长。在胡萝卜细胞培养中，加入2，4-D后诱导一些特异性多肽或蛋白质形成，当去除生长素后，这些多肽和蛋白质也随之消失。但在诱导出胚性细胞后，及时除去培养基中2，4-D，胚性细胞在深入分化和发育同时释放糖蛋白GP65（65kDa）（2）外源激素与体细胞胚发生

体细胞胚及人工种子第33页A,C,E为离体培养6周后体细胞胚；B,D,F为离体培养5个月后形成体细胞胚A:品种GK7，在添加83.0mMcentrophenoxine培养基上;B:品种AT120，在添加124.4mMcentrophenoxine培养基上;C:品种59-4144，在添加12.4mM

dicamba培养基上;D:品种AT120，在添加83.0mMdicamba培养基上;E:品种VC1，在添加83.0mM

picloram培养基上;andF:品种VC1，在添加124.4mMpicloram培养基上.图含不一样种类和不一样浓度生长素固体培养基上成熟花生胚轴体细胞胚诱导体细胞胚及人工种子第34页②其它生长激素与体细胞胚发生除2,4-D外，ABA对植物体细胞胚发生也起到主要调控作用。研究表明，ABA含有促进苈蒿体细胞胚结构正常化显著效应。在浓度适宜时，ABA能抑制各种异常体细胞胚发生，而且ABA加入培养基时间愈早其效应也越显著。较低浓度ABA对保持籼稻愈伤组织胚性结构含有主要意义，可显著提升这种胚性愈伤组织分化出苗率。在拐芹中ABA与NAA共同作用可诱导一些游离氨基酸含量改变和特异蛋白形成。ABA和PEG对胡萝卜(DaucuscarotaL.)体细胞胚发生含有调控作用大量研究表明，ABA对一些植物体细胞胚胎发生特异性基因表示起调控作用，激活相关基因表示，合成贮藏蛋白、晚期胚胎发生丰富蛋白和胚胎发生特异性蛋白。体细胞胚及人工种子第35页3多胺（腐胺、尸胺、亚精胺、高亚精胺、精胺等）和乙烯与体细胞胚发生**外源多胺对体胚发生作用除了取决于植物种类及其内源多胺情况之外，还关系到它们怎样被吸收、运输及降解等问题。多胺与体细胞胚发生关系在胡萝卜研究中较多。体细胞胚及人工种子第36页举例说明：**已发觉胡萝卜胚性细胞中腐胺、精胺含量比非胚性高，在胡萝卜体细胞胚发生前胚时期多胺含量普通较低，从球形胚、心形胚到鱼雷胚时期，精胺和亚精胺逐步升高，心形胚时期以腐胺为主，鱼雷胚时期则富含亚精胺。**在胡萝卜愈伤组织体细胞胚发生中发觉乙烯抑制体细胞胚发生，而乙烯形成酶抑制剂Ni2+、Co2+能够促进其体细胞胚发生。**有研究表明，只在胚细胞分化早期才与多胺生物合成关系较亲密。体细胞胚及人工种子第37页4糖类和金属离子与体细胞胚发生①

糖类**糖类对诱导植物体细胞胚发生也是不可缺乏主要成份。**研究表明，小麦愈伤组织一旦分化为胚性细胞后就有淀粉粒积累，在胚性细胞分化与发育整个过程中，淀粉两次合成高峰均在发育主要转折期，为体细胞胚深入发育和分化提供必要物质和能量基础。淀粉积累与胚性细胞分化能力和体细胞胚发育时期转折亲密相关。**在茴香胚性细胞中也富含淀粉粒，在体细胞胚发育中一样出现两次峰值，同时认为淀粉出现峰值与核酸和蛋白质合成亲密相关，所以，表明淀粉为蛋白质和核酸合成奠定了物质基础。体细胞胚及人工种子第38页碳水化合物浓度（mM）胚胎发育时期球形胚（％）心形胚（％）鱼雷胚（％）

葡萄糖Glucose55.492.4f1.2h1.2g110.996.8f2.6h2.4f166.4810.2e5.0f4.2e221.9813.6c7.2d6.4d

果糖Fructose55.496.2f2.8g2.4f110.9912.4c5.2f4.6c166.486.4f5.0f4.2e221.982.4h1.2h1.2g

蔗糖Sucrose29.2112.4c6.8c6.2d58.4320.2b16.2b14.6b87.6436.2a20.4a16.4a116.8612.6d10.2c8.4c

麦芽糖Maltose27.752.4h1.2hn.d55.515.4g2.6g1.2g83.261.2in.dn.d111.02n.dn.dn.d表在4.52μM/L2,4-D培养基上不一样碳水化合物对木豆愈伤组织悬浮培养体细胞胚发生影响体细胞胚及人工种子第39页②金属离子**金属离子对体细胞胚发生也有影响。**在小麦愈伤组织诱导体细胞胚发生中也发觉Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等金属离子含有主要促进作用，不但可提升诱导频率，而且还能够加速胚性愈伤组织形成，所以，在培养基中加入适合浓度金属离子可提升体细胞胚发生频率。**有研究表明，金属离子可能是经过促进多胺合成而提升体细胞胚发生频率。体细胞胚及人工种子第40页5外植体与体细胞胚发生不一样基因型、外植体体细胞胚发生能力不一样。如胡萝卜子叶不一样部位培养诱导发育过程不一样。只有表皮下细胞含有真正细胞全能性和有能力直接产生体细胞胚（胚胎发生区），而不用经过愈伤组织阶段诱导。体细胞胚及人工种子第41页表皮下细胞根发生区细胞芽发生区细胞胡萝卜子叶不一样部位外植体示意图体细胞胚及人工种子第42页6光与体细胞胚发生品种Jack（光照强度50-60µEm2s-1）品种

Fayette（光照强度50-60µEm2s-1）品种Jack（光照强度5-10µEm2s-1）品种Fayette（光照强度5-10µEm2s-1）(图光对大豆不一样品种子叶体细胞胚发生影响)体细胞胚及人工种子第43页举例:落叶松体细胞胚胎发生体细胞胚及人工种子第44页落叶松体细胞胚萌发研究体细胞胚及人工种子第45页第二节人工种子一人工种子概念二人工种子历史三人工种子各部分功效四人工种子特点五人工种子包括问题人工种子研制举例：火炬松人工种子人工种子应用前景体细胞胚及人工种子第46页第二节人工种子一、人工种子概念人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培养胚状体或芽包裹在含有养分和保护功效人工胚乳和人工种皮中类似种子颗粒。**人工种子可在一定条件下萌发生长，形成完整植株。体细胞胚及人工种子第47页人工种子依靠植物细胞“全能性”，美国首先创造“人工种子”

体细胞胚及人工种子第48页人工种子www.agr.hokudai.ac.jp不定胚形成人工种子www.brs.nihon-u.ac.jp人工种子大量生产kankyo08.en.a.u-tokyo.ac.jp人工种子结构示意图体细胞胚及人工种子第49页二、人工种子研究历史**1978年Murashige提出人工种子概念

**1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸钠包埋单个体细胞胚，生产人工种子。**胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝、莴苣、苜蓿等人工种子制作取得成功。**在我国人工种子研究已列入重点攻关项目，并已取得一些主要研究结果。体细胞胚及人工种子第50页三、人工种子各部分功效

1体细胞胚为了使人工种子在一定条件下萌发生长，并形成完整植株，人工种子首先应该具备一个能够很好地发育成完整植株能力胚，它含有胚根和胚芽双极性，经原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶形胚等不一样阶段发育而成。2、人工胚乳人工胚乳为体细胞胚萌发提供营养物质。依据使用者目标，可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需各种营养成份、防病虫物质、植物激素等，也是人工种子优越于天然种子之处。3、人工种皮包裹在人工种子最外层，对人工种子起到保护作用，保护人工种子内部水分和营养不致丧失和预防外部物理冲击，还要确保通气。体细胞胚及人工种子第51页五、人工种子与天然种子比较有其本身特点：

（1）可对一些自然条件下不坚固或种子很昂贵植物进行繁殖。（2）固定杂种优势，使Fl杂交种可多代利用，使优良单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限。（3）节约粮食。（4）在人工种子包裹材料里加入各种生长调整物质、菌肥、农药等，可人为地影响控制作物生长发育和抗性。(5)能够保留及快速繁殖脱病毒苗，克服一些植物因为长久营养繁殖所积累病毒病等。(6)与试管苗相比成本低，运输方便(体积小)，可直接播种和机械化操作。体细胞胚及人工种子第52页1、高质量和数量体细胞胚诱导。2、体细胞胚发生同时控制。3、人工种皮制造与生产。4、人工胚乳研制。5、工艺流程。6、贮藏。**取得体细胞胚是生产人工种子基础，其发生频率高低、胚质量和体细胞胚发生同时控制是生产人工种子关键。六、当前人工种子包括问题体细胞胚及人工种子第53页***人工种子制备包含胚状体诱导与同时化、人工种子包埋、人工胚乳制作、人工种皮制作、人工种子贮藏等步骤内容。

1、高质量和高产量体细胞胚诱导与同时化控制体细胞胚诱导与同时化控制方法：

七人工种子研制体细胞胚及人工种子第54页体细胞胚诱导与同时化控制

体细胞胚及人工种子第55页a成熟体细胞胚；b用无菌吸管吸收与包埋剂混合体细胞胚c带体细胞胚液滴滴入2％CaCl2溶液后形成白色半透明包埋丸；d人工种皮包埋制成人工种子人工种子制备体细胞胚及人工种子第56页苜蓿体细胞胚生产与植株取得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm

体细胞胚及人工种子第57页2、人工种子包埋取得发育正常、形态上较为一致体细胞胚后，就要用适合材料进行包埋。进行包埋时应做到以下几点：（1）包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，并能保护胚和胚发芽能力；（2）同时在制造、贮藏、运输和种植过程中必须含有耐久性；（3）胶囊必须含有养分和植物激素以及植物生长和发育所需成份和水分，并要求制作人工种子适合于农业机械化播种。体细胞胚及人工种子第58页3包埋方法：经研究认为藻酸盐所形成胶囊是当前最好凝胶包埋材料，所采取主要方法是滴注和装膜两种。（1）滴注法制备人工种子是将选择好体细胞胚悬浮于含2%～3%藻酸钠溶液中，然后用一个塑料吸管吸注含体细胞胚藻酸钠悬滴加入到0.1mol/LCaCl2溶液中，这时离子间发生交换而形成胶囊，胶囊直径依赖于吸管内径和吸注速度，胶囊大小，视体细胞胚大小和发芽能力而定，普通采取吸管口径为3－4mm，可得直径为4－5mm胶囊。体细胞胚包在胶囊中位置不宜处于中央，宜偏在一边以利萌发。至于聚合时间长短则依赖于所用试剂浓度。普通藻酸钠浓度控制在2％－3%，在CaCl2中停留实践不要超出10min，以免胶囊太硬而影响发芽。形成胶囊后转入无菌水中冲洗，最终在1/2MS培养基上作发芽和转换试验或深入包裹人工种皮。体细胞胚及人工种子第59页滴注法体细胞胚及人工种子第60页人工种子包埋过程示意图体细胞胚及人工种子第61页（2）装膜法制备人工种子是把体细胞胚混合到一个温度较高胶液中，然后滴注到一个有小坑微滴板上，伴随温度降低变为凝胶而形成胶丸。体细胞胚及人工种子第62页4、人工种皮研制美国杜邦企业生产Elvax4260是一个很好“人工种皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚产物，用它作为人工种子最外层包裹剂，即人工种皮取得很好效果。体细胞胚及人工种子第63页2、用Elvax作为人工种皮详细操作程序为：（1）、将4g藻酸钙胶囊置于20mL含0.1g葡萄糖和含0.2mL甘油氢氧化钠溶液中搅拌1min；（2）、在50mL环乙烷中加入10%Elvax4260;（3）、在40℃条件下溶解5g硬脂酸，10g鲸醋醇和25g鲸醋取代物，另加295mL石油醚和155mL二氯甲烷；(4)、将藻酸钙胶囊放在上述混合液中浸泡10s，取出后用热风吹干。如此重复4－5次，最终用石油醚冲洗洁净，经尼龙布过虑后在空气中风干即可。体细胞胚及人工种子第64页体细胞胚与人工种子体细胞胚及人工种子第65页1、人工种子转换定义**转换（Transformation）指人工种子在一定条件下，萌发、生长、形成完整植株过程。2、转换方法**转换方法可分为无菌条件下转换和土壤条件下转换。八、人工种子转换试验体细胞胚及人工种子第66页（1）、无菌条件转换：其也称离体条件转换。普通是将新制成人工种子播种在1/4MS培养基，附加1.5%麦芽糖、8g/L琼脂中，培养后统计人工种子形成完整植株数目，即人工种子转化率。（2）、无菌条件转换率高低主要取决于：（a）、对提升体细胞胚质量培养基成份研究；（b）、改进转换条件研究。如麦芽糖代替蔗糖，有利于体细胞胚萌发和转换。体细胞胚及人工种子第67页体细胞胚发育成植株，大致经历几个阶段：发芽根系发育芽分生组织生长和发育真叶生长芽和根连接正常植株生长兰花人工种子生产及其取得小植株体细胞胚及人工种子第68页（3）、土壤条件转换：也称活体条件下转换。人工种子真正目标是直接播种于土壤，即在活体条件下，使转换成功。（4）土壤条件下转换采取方法：a、无土培养试验：当前以蛭石或珍珠岩试验较多，附加低浓度无机盐，1/6MS培养基，0.75%麦芽糖有利于转换。b、土壤试验：人工种子土壤转化试验报道较少。苜蓿人工种子直接土壤转化试验已达20%，水稻不定芽研制人工种子经适当地过渡性培养，在土壤中转化率为10%。（5）、土壤条件转换人工种子转化率低主要限制因子a、研究无机盐在转换中主要性时表明，没有硝酸钾、硫酸镁、氯化钙时就不会发生转换，缺乏磷酸铵，转化率从30%降至5%。显然这些无机盐成份作为人工种子营养肥料是不可缺乏。b、0.75％（W/V）麦芽糖有利于提升转化率。所以推测，碳源在人工种子转换中也是限制因子。所以，必须在人工种子中贮藏必需养分或供给外源营养物质。体细胞胚及人工种子第69页九、人工种子储备与萌发人工种子储备时间长短和萌发率高低对人工种子应用至关主要。人工种子寿命，其最理想状态是能够与真正合子胚种子寿命一样长，只有这么，才有利于人工种子储备和萌发。另外，海藻酸盐胶囊本身又抑制呼吸，愈加缩短了体细胞胚寿命。所以，储备和萌发是人工种子研制主要难点之一。延长人工种子储备时间和提升其萌发率主要方法包含低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法等以及这些方法组合。干燥法和低温法是当前应用最多方法。体细胞胚及人工种子第70页低温储备是指在不伤害植物繁殖体前提下,经过降低温度来降低繁殖体呼吸作用,使之进入休眠状态。惯用温度普通是4℃。在此温度下体细胞胚人工种子可储1-2个月。如茶枝柑(Citrusreticulata人工种子,储存1个月仍具很高转化率。泡桐(Paulowniaelongata人工种子在储备30d或60d后体细胞胚存活率分别是67.8%和53.5%,萌发率分别是43.2%和32.4%。非体细胞胚人工种子能够在4℃下储备更长时间,Mandal等(对4种罗勒属(Ocimum)植物腋芽进行包被,可保留60d,并使植物耐寒性提升。Datta等(1999包被濒危植物地宝兰(Geodorumdensiflorum)类原球体,储备120d后,生存能力与储备前相比无显著改变。马铃薯芽尖在MS培养基上培养2d后,用海藻酸钠包被,储备270d、360d和390d后在MS培养基上萌发率分别是100%、70.8%和25%。因为人工种子没有像自然种子一样在储备前进入休眠状态,伴随低温储存时间加长,包被体系内含氧量降低,人工种子萌发率会下降（1）低温储备技术体细胞胚及人工种子第71页液体石蜡作为经济、无毒稳定液体物质,常被用来储备细菌、真菌和植物愈伤组织。美国已经有报道,把人工种子放在液体石蜡中,保留时间可达6个月以上。李修庆等(1990)研究胡萝卜人工种子结果表明:人工种子在液体石蜡中短时间保留(1个月)能较正常生长,但时间一长(79d),人工种子苗生长则显著比对照组差;并发觉液体石蜡对幼苗呼吸和光合作用有一定妨碍作用。在常温下液体石蜡不能经过抑制发芽来储备人工种子。干燥后人工种子,在2℃液体石蜡中,2个月后只有2%萌发。陈德富等(1990)对根芹(Apiumgraveolens)体细胞胚人工种子研究也得到一样结果。（2）液体石蜡储备技术体细胞胚及人工种子第72页超低温普通是指-80℃以下低温,如超低温冰箱(-80～-150℃)、液氮(-196℃)等。

在此温度下,植物活细胞内物质代谢和生命活动几乎完全停顿。所以,植物繁殖体在超低温过程中不会引发遗传性状改变,也不会丢失形态发生潜能。当前应用于人工种子超低温保留方法主要是预培养2干燥法,即人工种子经一定预处理,并进行干燥,然后浸入液氮保留。脱落酸(ABA)是一个植物逆境激素,能够诱导产生蛋白质、多胺、脯氨酸和淀粉等物质增加,使体细胞胚在干燥处理中受到保护。Nieves等()对甘蔗晚盾片期胚用3.8μmol/LABA或4.7μmol/L茉莉酸(jasmonicacid,JA)处理后进行包被,并在干燥器中用无水硅酸进行干燥处理,使其水含量降至60%或30%。结果发觉存活体细胞胚是由ABA处理胚,而用JA处理不能到达此效果。对于非体细胞胚人工种子,Khor等(1998)对龙舌兰原球茎用10-5MABA处理,经干燥脱水与包埋,也可取得极高存活率。（3）超低温储备技术体细胞胚及人工种子第73页（4）干燥法干化人工种子更像天然种子，含有更长储备寿命。Gray等（1987）在23℃条件下干化鸭茅体细胞胚21天，萌发率到达12％。Hammatt等（1987）把大豆体细胞胚干化到原