纸层析法分离氨基酸专家讲座

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸专家讲座第1页试验目标

1、掌握分配层析原理，学习氨基酸纸层析法操作技术(包含点样、平衡、展层、显色、判定及定量)。2、学习未知样品氨基酸成份(水解、层析及判定)分析方法。纸层析法分离氨基酸专家讲座第2页试验原理

层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。1944年应用滤纸作为固定支持物“纸层析”诞生以来，层析技术发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于试验室分离分析，又适合用于工业生产中产品分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少分析工具之一。纸层析法分离氨基酸专家讲座第3页分配层析

分配层析法是利用不一样物质在两个互不相溶溶剂中分配情况不一样而使之得到分离方法。分配层析法中不一样溶质分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数不一样。分配系数(K)定义是：K=溶质在固定相浓度(CS)/溶质在流动相浓度(CL)纸层析法分离氨基酸专家讲座第4页二、纸层析(一)原理

纸上层析实际上是以滤纸纤维结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不停地进行分配。因为各物质有不一样分配系数，移动速度所以不一样，从而到达分离目标。

纸层析法分离氨基酸专家讲座第5页纸层析法分离氨基酸专家讲座第6页溶质在滤纸上移动速率可用Rf值表示：Rf=X/Y式中X：溶质斑点中心移动距离Y：溶剂前沿移动距离Rf值决定于分配系数。不一样物质分配系数不一样，Rf值也不相同，由此能够依据Rf值大小对物质进行定性分析。

纸层析法分离氨基酸专家讲座第7页(二)影响Rf值主要原因

物质结构和极性

物质结构和分子极性是影响Rf值主要原因。极性较大物质，在水中溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。2.滤纸

不一样滤纸厚薄程度和纤维松紧度各不相同，所以结合水量不一样，两相体积比也就不一样。所以同一个物质在不一样型号滤纸上进行层析时，所得到Rf值也不相同。另外，滤纸上所含杂质也会影响Rf值。

纸层析法分离氨基酸专家讲座第8页3.层析所用溶剂

同一物质在不一样溶剂系统中进行层析时，Rf值不一样。所以溶剂配制和使用必须严格，才能使Rf值重现性好。在好溶剂系统中被分离物质Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分Rf之差最好大于0.05。溶剂系统中试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理方法因溶剂性质而异。惯用处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等纸层析法分离氨基酸专家讲座第9页4.pH值

溶剂和样品pH值会影响物质解离，从而影响物质极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂酸碱度增大则流动相含水量增高，使极性物质Rf值增加；反之则降低。为了防止或降低pH值对Rf值影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定pH值。5.温度

温度能影响物质在两相中溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维水合作用，即影响固定相体积.所以温度改变使Rf值改变很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。

纸层析法分离氨基酸专家讲座第10页6.展开方式

同一物质在其它层析条件完全相同情况下，用不一样展开方式进行层析时，所得到Rf值不相同。用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，因为内圈较外圈小，限制了溶剂流动，Rf值也较小。7.样品溶液中杂质

样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。比如：氯化钠存在会影响氨基酸Rf值。纸层析法分离氨基酸专家讲座第11页(三)操作方法

1.样品处理

用作纸层析样品，应尽可能除杂纯化。调整到一定pH值，浓度太低可用真空浓缩提升浓度，浓度太高则需稀释。2.点样

将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器)轻轻点在原点上。样品点直径约0.3-0.5cm。点样量应依据纸长短以及样品性质来决定，普通每一样品量为5-30μg。点样普通采取少许屡次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样位置应完全重合，不然会出现斑点畸形现象。纸层析法分离氨基酸专家讲座第12页纸层析法分离氨基酸专家讲座第13页3.平衡

点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好溶液系统蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统组成,严重影响层析效果。平衡普通在密闭层析缸内进行。纸层析法分离氨基酸专家讲座第14页4.展开

平衡结束后，将滤纸靠样品点一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿抵达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标识，晾干或用冷风吹干。按溶剂在滤纸上流动方向不一样，展开有上行、下行和环行三种方式。(1)上行法：将滤纸点样一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力作用从下向上流动。上行法操作简单，重现性好，是最惯用展开方法，但展开时间较长。(2)下行法：在层析缸上部有一盛展开剂液槽，将滤纸点样一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值重现性较差，斑点易扩散。纸层析法分离氨基酸专家讲座第15页

(3)环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不停向四面水平方向流动。因为溶剂向圆周方向扩散，所以展开图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性特制滤纸。（4）双向展开法：假如样品组分较多，用一个溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸一角，用一个溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一个溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。

纸层析法分离氨基酸专家讲座第16页5.显色

为了显示层析斑点位置，可依据物质性质不一样，采取显色剂显示或紫外光显示。(1)显色剂显示：被分离物质与显色剂生成有颜色化合物，显示斑点位置。惯用喷雾法、浸渍法或涂刷法。(2)紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质斑点。6.定性分析

层析后斑点显示出来后，计算出各斑点Rf值，就能够对物质进行定性。纸层析法分离氨基酸专家讲座第17页7.定量分析

对被分离物质进行定量方法很多，惯用有：(1)剪洗比色法：将斑点剪下，用适当溶剂洗脱后，经过分光光度计进行比色定量。(2)直接比色法：用特制分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色浓度，画出曲线，由曲线所包含面积可求出待测物含量。(3)面积测量法：试验证实，圆形或椭圆形斑点面积与物质含量对数成正比。所以，可用测量斑点面积方法求得物质含量。纸层析法分离氨基酸专家讲座第18页纸层析法分离氨基酸专家讲座第19页试验材料与试剂

试验试剂1、氨基酸标准液(1mg/mL)五种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分别配制成一定浓度溶液。2、展开剂是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2(正丁醇：水：乙酸=4：1：1)3、0.2%茚三酮丙酮溶液。4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)。纸层析法分离氨基酸专家讲座第20页试验器材:1、滤纸。2、培养皿(直径115mm)。3、电热鼓风干燥箱。4、喷雾器及吹风机。5、点样管及点样架。6、针、线、尺。7、烧杯(50mL)。纸层析法分离氨基酸专家讲座第21页试验操作

（一）、标准氨基酸纸上层析1、单向上行层析(1)、氨基酸Rf值测定A、滤纸：选取国产滤纸，10cm×20cm，在距纸边2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔2cm处画一小圆圈作为点样处，圈直径不超出0.3cm。纸层析法分离氨基酸专家讲座第22页B、点样：点样要适当，样品点太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸点样量以每种氨基酸含5～20μg为宜，用点样管(也可用血色素管代替)吸收氨基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处中心，这时样品就自动流出。点样扩散直径控制在0.3cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用一加热装置(如吹风机)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，尤其是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。将点好样品滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸两边不要接触。防止因为毛细管现象使溶剂沿两边移动尤其快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。纸层析法分离氨基酸专家讲座第23页C、展层：将揉成圆筒状滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸上沿约1cm时，取出滤纸，马上用铅笔标出溶剂前沿位置，晾干，使纸上溶剂自然挥发，直至除净溶剂。酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮5ml。温度25℃，时间1h。注意：使用溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。展层溶剂每张约需25mL。纸层析法分离氨基酸专家讲座第24页D、显色：待展层基本结束后,，置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。纸层析法分离氨基酸专家讲座第25页E、Rf值计算：用尺测量显色斑点中心与原点(点样中心)之间距离和原点到溶剂前沿距离，求出此值，即得氨基酸Rf值。计算出5种氨基酸在酸系统