《DNA的粗提取与鉴定》2

DNA的粗提取与鉴定DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有效提取要求材料中的DNA尽可能少地降解。但用于生药真实性鉴别的药材在干燥、加工、贮藏等过程中均造成了DNA不同程度的降解，一般DNA的含量也比较低。药材中次生代谢产物含量较高，会干扰提取。另外也可能有微生物引起的外源DNA的污染。DNA的质量将直接关系到实验的成败。不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。请思考：1．DNA是怎样提取的？2．DNA是怎样进行鉴定的？1．DNA的粗提取(1)基本思路：利用DNA与______、________和______等在物理和化学性质方面的______，提取DNA，去除其他成分。(2)方法和原理：①DNA和________等其他成分在不同浓度的______溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的________就能使DNA充分溶解，而使______沉淀，或者相反，以达到分离目的。一、DNA的粗提取和鉴定

RNA

蛋白质脂质差异蛋白质

NaCl

盐浓度杂质②DNA不溶于______，但是某些______则可溶于其中。③______能水解蛋白质，但是对______没有影响。④大多数蛋白质不能忍受________的高温而发生变性，而DNA在________以上才会变性。⑤________能瓦解细胞膜，但对DNA无影响。酒精蛋白质蛋白酶

DNA

60～80℃

80℃

洗涤剂2．DNA的鉴定在沸水浴的条件下，DNA遇________会被染成蓝色。二苯胺二、实验设计1．选取实验材料选用______________的生物组织，成功的可能性更大。2．破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的________，同时________________，过滤后收集滤液即可。如果是植物细胞，需要先用________溶解________。

DNA含量较高蒸馏水用玻璃棒搅拌洗涤剂细胞膜3．去除滤液中杂质(1)方案一：通过控制________的浓度去除______。(2)方案二：直接向滤液中加入____________，反应10～15min，________中的____________能够分解蛋白质。(3)方案三：将滤液放在__________的恒温水浴箱中保温10～15min，注意严格控制温度范围，使________沉淀析出而________分子还未变性，可以将DNA与蛋白质分离。

NaCl溶液杂质嫩肉粉嫩肉粉木瓜蛋白酶

60～75℃

蛋白质

DNA4．DNA的进一步提纯利用DNA不溶于冷却的________这一原理，可从______中析出较纯净的DNA，此时DNA的状态为____________。5．DNA的析出与鉴定(1)DNA的析出：DNA的析出用的是与滤液体积相等的、______的______溶液。

95%酒精滤液白色丝状物冷却酒精(2)DNA鉴定：鉴定DNA时在试管中先加入物质的量浓度为________的NaCl溶液5mL。两支试管中其中一支加入DNA丝状物，各加入二苯胺________。在沸水浴的条件下，DNA遇__________会被染成蓝色，因此__________可以作为鉴定DNA的试剂。

2mol/L

4mL

二苯胺二苯胺三、操作提示(1)以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g________，防止________。(2)加入洗涤剂后，动作要________________、________，否则容易产生大量的________，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免______________________，导致DNA分子不能形成____________。(3)鉴定DNA用的染色剂________试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。柠檬酸钠血液凝固轻缓柔和泡沫加剧DNA分子的断裂絮状沉淀二苯胺一、DNA粗提取的原理1．DNA溶解度溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白质NaCl溶液浓度从2mol/L降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀溶解总结①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低，在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大；②选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的2.DNA与蛋白质对蛋白酶、高温、洗涤剂的耐受性的区别DNA蛋白质蛋白酶无影响水解高温80℃以上才会变性60～80℃会变性洗涤剂无影响瓦解细胞膜(破坏膜中的蛋白质分子)

盐析和高温对DNA活性的影响不同①盐析过程DNA的空间结构不变，没有变性，只是溶解度降低。②高温使DNA和蛋白质变性时破坏的键不同。DNA变性时，氢键被破坏，而蛋白质变性时往往破坏二硫键，因此降温时DNA能复性，而蛋白质不能。例1

DNA在NaCl溶液中的溶解度有两重性，随NaCl溶液浓度的变化而变化，则下图所示能反映DNA的溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是(

)解析：DNA在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最低。答案：C1．蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来，下列药品可达到上述同一目的的是(

)A．蒸馏水B．NaCl溶液C．NaOH溶液D．盐酸解析：DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，蛋白质可溶，从而把DNA和蛋白质分开。答案：B二、DNA的粗提取和鉴定的实验过程的分析１.0.1g/ml的柠檬酸钠溶液,按1:2的比例与新鲜鸡血混合搅拌均匀。２.将血液置于冰箱中24小时,弃上部澄清液３.取烧杯中的血细胞液约5~10ml加入到100ml烧杯中，向烧杯中加入20ml蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌5分钟，加速血细胞在低渗溶液中的破裂４.将2mol/L的氯化钠溶液50ml缓缓倒入烧杯中，用玻棒沿一个方向搅拌，使DNA溶解于氯化钠溶液中，滤除杂质，获得粘稠状的鸡血细胞DNA提取液５.将鸡血细胞DNA提取液置于较大的烧杯中，沿烧杯内壁缓缓倒入蒸馏水，并不断搅拌，直到粘稠状DNA不再析出为止。用玻棒搅拌，使析出的DNA缠绕于玻棒末端。６.将析出的DNA再溶解于2mol/L的氯化钠溶液中。７.在DNA的氯化钠溶液中倒入95%的酒精50ml（冷却过的酒精效果较好），使DNA再次析出，用玻棒搅拌，使DNA再次缠绕于玻棒末端。８.DNA的鉴定：取两支试管，各加入2ml0.015氯化钠溶液，将DNA溶解于其中一支试管中，另一支做为对照组。然后，在两支试管内加等量的二苯胺试剂，水浴加热10min左右，冷却，观察实验现象。2．实验过程中的几点注意事项(1)实验中两次加入蒸馏水的目的不同：①第一次的目的是使鸡血细胞吸水涨破，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分吸水涨破。②第二次的目的是为了稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出。(2)实验中三次加NaCl溶液的目的：①第一次加入NaCl溶液后必须充分搅拌，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在NaCl溶液中。②第二次加入NaCl溶液的目的是使DNA溶解。③第三次(即DNA鉴定环节)中加NaCl溶液的目的是溶解DNA。(3)实验中六次搅拌的目的：目的第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液，加速细胞破裂第二次搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速DNA的溶解第三次搅拌加蒸馏水的NaCl溶液，均匀稀释以析出更多DNA第四次搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速DNA的溶解第五次搅拌含DNA的酒精，提取含杂质较少的DNA第六次搅拌含DNA白色丝状物的盐溶液，加速DNA的溶解①哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，无DNA分子，不能作为提取DNA的实验材料②若选取肝脏细胞或植物细胞，由于肝组织含较多蛋白质纤维，植物组织有胞间连丝和细胞壁，则必须充分研磨。③过滤时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。④相关试剂的作用辨析：a．柠檬酸钠：作为抗凝剂，防止血液凝固。b．洗涤剂：能够瓦解细胞膜，释放内含物DNA。c．食盐：可以加速核蛋白解体，游离出DNA分子。例2

(双选)下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是(

)试剂操作作用A柠檬酸钠与鸡血混合防止血液凝固B蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入溶解有DNA的NaCl溶液中析出DNA丝状物D冷却的酒精加入过滤后含DNA的NaCl溶液中产生特定的颜色反应解析：在DNA粗提取与鉴定实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/LNaCl溶液中的溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(水浴加热)产生蓝色反应。答案：AC2．下列关于DNA的粗提取和鉴定的有关说法，正确的是(

)A．DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的增大而增大B．溶有DNA的NaCl溶液中加入4mL二苯胺试剂即变蓝色C．DNA粗提取和鉴定时，选材最好用鸡血而不用猪血D．提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，食盐有利于DNA从细胞中释放出来解析：从DNA在NaCl溶