前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座

1前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen，PSA)是分子量34000单链糖蛋白，由237个氨基酸组成，它是一个丝氨酸蛋白酶，使凝固精液溶解、液化。它是在1979年作为前列腺腺上皮细胞标志物被发觉。血清PSA当前已被广泛应用于前列腺癌早期筛查。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第1页PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮内瘤，均呈阳性表示，定位于上皮细胞胞质中，而在前列腺转移癌则呈阴性表示，所以PAS阳性提醒肿瘤来自前列腺上皮，可用于区分前列腺癌与前列腺转移癌[5]。PSA在前列腺良、恶性病变中均呈阳性表示，故PSA不能用于判别良恶性病变。几乎全部前列腺癌（除了分化最差癌和少数激素治疗后复发进展期癌以外）PSA标识都阳性，而高分化前列腺癌PSA表示强于低分化前列腺癌,表明PSA表示与分化程度相关。而对于分化很差癌，即使PSA阴性也不能完全排除前列腺癌，还要结合其它检验综合考虑。偶然PAS阳性可出现在前列腺以外组织和肿瘤，但普通为局灶性弱阳性[6]。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第2页[5]HarveyAM,GriceB,HamiltonC,eta1.Diagnosticutilityofp504s/p63cocktail,prostate-specificantigen,andprostaticacidphosphataseinVerifyingprostaticcarcinomainvolvementinseminalVesicles:astudyof57casesofradicalprostatectomy,specimentsofpathologicstagepT3b[J].ArchPatholLabMed,,134(7):983-988.[6]BostwickDG,QianJ,RamnaniDM.Immunohistochemistryoftheprostateandbladder,testisandrenaltumors.In:DabbsDJ,ed.DiagnosticImmunohistochemistry.Philadelphia:ChurchillLivingstone,.407-33前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第3页CK34βEl21984年，Gown等[7]首先报道了CK34βEl2，它是一个高分子量57000～66000细胞角蛋白。CK34βEl2标识良性前列腺组织，仅在前列腺基底细胞细胞膜以及细胞质中表示，而不在前列腺分泌上皮细胞表示，故CK34βEl2可作为对前列腺基底细胞层进行选择性标识[8]。因为基底细胞消失是诊疗前列腺癌主要形态学依据，而苏木素-伊红染色切片判断基底细胞是否存在常十分困难，所以用CK34βEl2标识基底细胞就成为前列腺良恶性判别诊疗主要伎俩之一。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第4页在正常和良性增生以及上皮内瘤前列腺腺体，导管周围形成连续或断续CK34βE12分布。而前列腺癌腺体基底细胞层完全消失，所以最终表现为CK34βE12不表示。但CK34βE12标识基底细胞可部分阴性，对经尿道电切标本，常因标本经人为烧灼而受影响，所以可靠性和稳定性欠佳。有20%～30%前列腺癌导管腺癌和筛状癌周围有连续或间断基底细胞，而部分良性前列腺病变,如腺病和不完全性萎缩腺泡周围基底细胞可部分甚至完全消失。说明基底细胞消失并非诊疗前列腺癌绝对指标。而免疫组化操作不妥，则有可能出现假阴性结果而误诊。故免疫组化结果应结合HE切片中其它形态学特征综合判断。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第5页P631998年，Okada等[9]分离出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族组员，位于人类染色体3q27-29。P63能特异性地标识前列腺基底细胞，呈胞核阳性，棕黄色颗粒状，故而能够显示基底细胞存在，而前列腺分泌上皮细胞则呈阴性[10]。绝大多数前列腺良性增生及低级别上皮内瘤腺体周围展现连续性P63分布；而高级别上皮内瘤可见P63不一样程度间断消失，而前列腺癌中腺体周围P63为阴性，显示基底细胞已经完全消失。所以，P63也可用于前列腺癌判别诊疗。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第6页CK34βE12、P63均可用于标识基底细胞，而作为诊疗前列腺癌有力伎俩。P63与CK34βEl2相比，含有以下优点：①部分CK34βE12标识阴性基底细胞，P63标识可呈阳性；②对有烧灼经尿道电切前列腺标本，P63标识结果比较稳定。③P63标识基底细胞呈核阳性，结果轻易判断，背景比较清楚。缺点则是其阳性表示是间断，当可疑腺泡少时，判断其基底细胞是否消失有时比较困难。在实际应用中，二者含有互补作用。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第7页基底细胞消失是前列腺癌主要诊疗依据，但局部基底细胞缺失却不能作为诊疗前列腺癌唯一标准。因为前列腺癌可有残留基底细胞，而且浸润性癌在管腔内扩散及良性腺体陷入癌组织中[11],所以个别前列腺癌中CK34βEl2与P63亦有阳性表示。少数前列腺增生病变基底细胞标识亦呈阴性表示，说明少数前列腺良性腺体基底细胞能够不连续或不能被证实存在，这也提醒基底细胞免疫标志物阴性不能单独作为确诊恶性指标。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第8页α-甲基-辅酶A-消旋酶(P504s)Jiang等[12]首次将P504s抗体应用于前列腺癌诊疗。P504s即α-甲基-辅酶A-消旋酶((alpha-methylacyl-CoAracemase)，其基因定位于染色体5P13，它所编码蛋白由382个氨基酸组成，在支链脂肪酸β-氧化和衍生过程中起作用。P504s在前列腺癌中高表示，而在正常中前列腺组织中则呈阴性或灶性弱阳性。Jiang等在所检测137例前列腺癌中阳性率高达100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特异性标识物。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第9页P504s阳性，CK34βEl2和p63阴性，能从正反两面支持前列腺癌诊疗，从而大大提升前列腺癌诊疗正确率[13]。然而，临床上并非全部前列腺癌都是P504s阳性，CK34βEl2及p63阴性，也并非全部前列腺良性病变都是P504s阴性，CK34βEl2及p63完整阳性。杨京哲[14]等人试验中，P504s不但在前列腺癌中有高表示，而且在前列腺上皮内瘤中也高表示，这表明P504s不但对前列腺癌敏感，而且对PIN也非常敏感，故用P504s只能区分前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN判别开来。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第10页WHO中，P504s在前列腺癌阳性率为80%以上，但在一些前列腺癌如泡沫状腺癌、萎缩性癌、假增生性癌和治疗后前列腺癌中阳性率比较低。而且P504s在12%良性增生，17.5%前列腺腺病，萎缩型腺体以及90%以上高级别PIN中呈阳性反应。另外，P504s在前列腺以外肿瘤如尿路上皮癌、结肠癌、肾癌以及良性肾源性腺瘤也可阳性。这表明P504s没有组织特异性，不是前列腺癌特异性标志物。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第11页总而言之，免疫组化在前列腺癌诊疗中应用含有主要价值，但决不能完全依靠免疫组化去诊疗前列腺癌，单独P504s(或基底细胞标志物)阳性或阴性均不能确诊前列腺癌。只有将组织病理形态与免疫组化染色结果结合起来，全方面分析，综合判断，才能有效地防止误诊。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第12页免疫酶细胞化学试验技术---实用免疫细胞与核酸技术（周德山）免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）中最惯用方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在前提条件下，借助于酶细胞化学伎俩，检测某种物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析形态学研究方法。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第13页为克服荧光抗体法不足、并能在超微结构水平定位抗原物质存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替荧光色素标识抗体，进行组织细胞内抗原或半抗原定位，开辟了酶标抗体技术免疫酶细胞化学之路。结合笔者经验，介绍ICC染色中主要程序：组织标本固定、切片、染色原理及步骤、结果判定及一些进展、特殊应用等供读者参考。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第14页第一节固定和切片一、固定若想得到理想ICC染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质不动性（Immobility）和免疫活性也是至关主要。换言之，假如抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，不论怎样努力染色都是徒劳，所以说固定是ICC染色中非常主要一环。ICC与其它组织学技术不一样，除要求保留良好结构外，还需保留组织抗原免疫活性。普通认为，新鲜组织能够最大程度地保留组织抗原免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第15页Cumming（1980）汇报，不固定组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定目标是使组成组织细胞成份蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并快速使组织细胞中各种酶降解、失活，预防组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞完整性和所要检测物质抗原性。所以快速充分固定是ICC染色成功关键一步。用于ICC固定剂种类较多，选择时应依据所要检测物质抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最正确筛选。制片及固定方法见第一章，下面介绍两种近年报道新方法。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第16页1．AMEX（AcetoneMethEnzoateXylene）法是改良冰冻置换法（freezesubstitution）简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)汇报，该法含有同新鲜（未固定）组织冰冻切片一样抗原保持性和石蜡切片良好组织结构保留。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水份逐步被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮过夜。实际上组织在4℃丙酮内过夜亦可得到一样效果。如在该固定液内加入少许蛋白酶活性阻断剂，并采取低溶点石蜡包埋等，可取得更佳染色结果。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第17页微波固定（Microwavefixation）为近几年所注目标问题之一。该方法能保持良好组织结构和抗原性，适于各种切片酶组化、ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波（频率1000～3000MHz）含有被水分吸收性质（通常所用微波是频率2450MHz，波长12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运动加紧，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成份反应，短时间内到达固定效果等相关。经微波照射固定组织，需置相同固定液中，继续固定2～6h，室温。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第18页二、切片光镜ICC染色，惯用有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应依据抗原性质、试验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片为ICC研究所首选。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第19页Shi（1991）等汇报：微波炉照射切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热作用，使核内DNA双链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露相关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，重复屡次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉液体，照射温度不超出90～95℃为宜。此处理后，细胞核染色以苏木精为佳前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第20页第二节染色方法一、本科标抗体法酶标抗体技术是经过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物特异催化作用，生成有色不溶性产物或含有一定电子密度颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成份定位。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第21页（一）酶种类及特点从理论上讲，用细胞化学方法能显示酶，均可用于标识抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用酶并不多。现将惯用几个酶列于表4-1，供选取时参考。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第22页前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第23页Sternberger(1986)指出，用于标识酶应具备以下几点①酶催化底物必须是特异，且轻易被显示，所形成产物易于光镜或电镜下观察；②所形成终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③较易取得酶分子，最好有商品出售；④中性pH时，酶应稳定，酶标识抗体后，保留1～2年活性不应改变，且酶催化活性（Turnover）越高越好；⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者活性；⑥被检测组织中，不应存在与标识酶相同内源性酶或类似物质。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第24页（二）本科标抗体制备（Boosma,DM,1983）酶标抗体与荧光色素标识抗体不一样，它需借助桥-偶联剂作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一个双功效试剂，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间连结，必须是不可逆，即借共价键连结；②偶联剂不应影响酶和抗体活性；③不能因偶联剂加入，使酶与组织成份了生非特异结合。抗体制作步骤未列出前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第25页（四）染色原理及步骤1．基本原理酶标抗体与荧光色素标识抗体染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标识在每一抗体上，间接法是将酶标识在第二抗体上，检测组织细胞内特定抗原物质。间接法所用第一抗体是对组织细胞内某种抗原特异性抗体（80%～90%抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体则为第一抗体（家兔/小鼠IgG）抗体。所以，只要不一样第一抗体均来自同一个属，同一标识第二抗体就能用来显示其不一样特异性抗原存在，这么可防止了直接法中标识每一个第一抗体麻烦，而且提升了方法敏感度。当前ICC染色中，以间接法为惯用，在此着重介绍间接法染色程序。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第26页2．染色程序（1）切片准备：见第一章。①石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上。（2）未固定新鲜组织切片，丙酮固定20～30min(fretrieval)，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成空间遮蔽（室温），风干15～30min.;已固定组织冰冻切片及石蜡切片，依据需要可进行组织抗原激活。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第27页（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以防止孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节省抗体用量，保持切片与抗体充分接触，风干。石蜡切片（滴少许PBS，以防其干燥）直接进行步骤（6）。（4）切片经PBS或其它缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰冻切片上OCT包埋剂。但应用ALP标识抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使ALP失活。（5）依据需要，用甲醇+0.3%H2O2处理切片15～30min（室温），封闭内源性过氧化酶活性。应用ALP标识抗体时，此步可省略。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第28页（6）PBS漂洗2min（共两次），移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%TritonX-100)中5min（室温）。Tween-20为一个表面活性剂，除含有清洁作用外，还可增加组织通透性，有利于组织细胞内抗原显示。（7）4%BlockAce或0.1%～1%BSA湿盒内孵育15～25min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体非特异性结合，降低背景染色。（8）依据需要，可用1/5～1/30正常来活兔/羊血清孵育15～20min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入1%～2%同一个属正常血清。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第29页9）轻轻弃去孵育液，滴加含0.2%BSA/0.05NaN3/PBS稀释第一抗体（抗体用量：每张切片普通为50～80μl），湿盒内孵育1～2h（20～25℃）；免疫电镜用标本，4℃过夜。（10）PBS充分冲洗（3次×2min），以去除切片上非特异吸附抗体。应用不一样第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。（11）经0.05%Tween-20/PBs2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀释HRP酶标识第二抗体,湿盒内孵育45～60min(20～25℃)。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第30页（12）PBS漂洗（3次×2min）,此处不需分别漂洗，因全部切片均系同一酶标抗体孵育。（13）未固定或固定较弱冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中磷酸与后面使用固定液中CaCl2形成磷酸钙而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保留第一抗体孵育前组织抗原，尤其适合用于单克隆抗体ICC染色。前列腺癌方面免疫组化基础知识专家讲座第31页（14）呈色：HRP标识抗体呈色液为0.01%～0.1%H2O20.01%～0.05%DAB0.05～0.1mol/LTris–HCl(pH7.4)。切片经PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察标本，呈色3～5min即可，预防DAB终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，防止DAB本身氧化变质。新配制DAB为无色透明液体。若DAB液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。（15）将切片置流水中（仅光镜观察）或PBS（电镜标本）内，终止呈色反应。（16）未固定冰冻切片，可